ELISA检测乳中牛结核抗体的研究.pdf

HeilongjiangAnimalScience
72andVeterinaryMedicine32006

ELISA检测乳中牛结核抗体的研究
徐凤宇,高云航,何昭阳*
(吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118)

中图分类号:S858.23文献标识码:B文章编号:10047034(2006)03007202

结核病是由结核分支杆菌引起的一种严重的慢性箱中过夜。次日甩去包被液,用洗涤液洗涤3次,每
人畜共患传染病,曾经是人类历史上最猖獗的传染病之次3min(以下简称33min洗涤)。将牛乳用稀释
一。试验以牛乳为试验材料,建立一种诊断牛结核病的液适当稀释,每孔加入100L,37温育40min,3
间接ELISA方法,目的是为诊断牛结核病找到一种更快3min洗涤。将酶结合物用0.05%BSAPBST液稀
捷、简便的方法,减少人力资源的投入,减轻医务工作者释至工作浓度,每孔加入100L,37温育40min,
的劳动强度,便于ELISA方法在临床上应用。33min洗涤。加入新鲜配制的底物OPD100L,
1材料与方法37湿盒避光作用30min。加入终止液50L终止
1.1材料反应,以DG3022型酶联免疫检测仪,以波长490nm
1.1.1抗原牛结核PPD,购于黑龙江省生物制品条件下测定OD值,每板同时设标准阴性、标准阳性
一厂(批号为9902)。及空白对照。被检样品的OD值/标准阴性样品的
1.1.2牛乳阳性牛乳为牛结核变态反应阳性,涂OD值2.0时,判定被检样品为阳性。
片镜检或细菌分离培养呈阳性,其血清经多次1.2.6特异性试验阻断试验:以抗原包被反应板,
ELISA检测OD值大于临界值的病牛的牛乳。阴性取结核标准阳性牛乳3份,其中2份分别与过量的草
牛乳为牛结核变态反应阴性,细菌学检查呈阴性,其分支杆菌干粉、牛结核分支杆菌干粉混合,37感作
血清经多次ELISA检测OD值小于临界值的健康牛2h,中间不时振荡,然后离心去除沉淀物,检测其OD值。
的牛乳。交叉反应试验:取5份副结核病牛牛乳根据此法
1.2方法做ELISA试验,检测其结果。
1.2.1兔抗牛抗体的制备按照常规方法进行。符合性试验:取已知牛结核血清ELISA阴性牛
1.2.2兔抗牛IgG酶标抗体的制备按照常规方的牛乳112份作牛乳ELISA试验,检测其结果。
法进行。1.2.7敏感性试验对24头份结核血清ELISA反
1.2.3常规牛结核血清ELISA方法参照逄魁春应阳性牛的牛乳作牛乳ELISA试验,检测其结果。
介绍的方法进行。1.2.8重复性试验选取数份结核阴、阳性牛乳加
1.2.4牛乳的前处理入防腐剂(0.01%叠氮钠)分别于4条件下保存1,
1.2.4.1全乳与脱脂乳的试验效果比较将全乳分2,4,7d,作ELISA试验,检测其结果。同时将结核
别置于4的冰箱中静止24h去乳脂;2000r/min阴、阳性牛乳连续3次作ELISA试验,检测其结果。
离心10min处理后去乳脂。将用以上两种方法处理1.2.9稳定性试验将结核阴、阳性牛乳分别冻融
后的脱脂乳和全乳分别做ELISA试验,比较其结果。1,2,3次,进行ELISA试验。同时将结核阴、阳性牛
1.2.4.2去酪蛋白前后的效果比较将脱脂乳进行乳分别加热至65并持续30min,或加热至74
4000r/min离心30min、8000r/min离心30min、持续10min后再进行ELISA试验,与未加热的阴、
12000r/min离心30min等不同离心条件的处理,阳性牛乳进行对照。
同时设对照组,找出最适离心条件。同时将脱脂乳用2结果
盐酸进行处理,观察其去除酪蛋白的效果。2.1牛乳的前处理
1.2.5牛乳ELISA检测方法用0.01mol/L、pH2.1.1全乳与脱脂乳的试验效果对4静置24h
值为9.6的碳酸盐缓冲液将PPD稀释成30g/mL,与2000r/min离心10min两种去乳脂方法的效果进行
用加样器每孔加入100L,37温育3h,于4冰比较,结果表明效果均较好。全乳ELISA试验结果表明,
阳性牛乳的OD值明显低于脱脂乳的OD值(见图1)。
收稿日期:200502032.1.2去除酪蛋白前后的脱脂乳试验效果经离心
作者简介:徐凤宇(1972),女,讲师,硕士研究生.和酸处理去除酪蛋白。试验表明酸处理时,pH值难
通讯作者:何昭阳(1943),男,教授,硕士.以控制。将牛乳分别经离心处理结果表明,离心、不
《黑龙江畜牧兽医》2006年第3期73

离心后,阴、阳性牛乳OD值差异不明显(见图2)。性牛乳进行重复试验。结