ba结核分枝杆菌差异表达基因消减cDNA文库.pdf

万方数据

·免疫学技术与方法·应用抑制消减杂交技术构建结核分枝杆菌差异表达基因消减cDNA文库①MycobacteriumConstructionbydifferentiallyin两次抑制性PCR，在消减杂交过程中使丰度不同的cDNA拷贝数趋于平衡，灵敏度提高，保证了较低丰基因分离方法相比表现了独特的优越性¨』。结核分枝杆菌(Mycobaeterium是肺结核的病原菌，尽管目前有可以选择的治疗方法，但是每年仍然有两百万人死于肺结核。目前大约新发肺结核病例心J。通过比较基因组之问的差异，探索结核分枝杆菌的致病分子机理、筛选结核致病菌的究热点13j。本研究选择结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株1-137Ra为SSH的研究对象，成功构建了这刘艳群杜先智(重庆医科大学第二附属医院呼吸内科，重庆400010)ofsubtractedcDNAlibrarysuppressionhybridizationforexpressedgenestuberculosisYo／-t-Q／／／t，DUofRespiratoryAffiliated抑制消减杂交(Suppressiontion，SSH)是20世纪90年代末出现的一种新的筛选差异表达基因技术，此技术应用两次消减杂交和度的差异表达基因也得到有效的克隆，与其它差异tuberculosis，MTB)有三分之一的人感染了MTB，每年有七百万到八百万毒力基因、寻找及鉴定结核分枝杆菌毒力基因成为研两种菌株之间差异表达基因的消减cDNA文库，为进型撞登笠壅旦塑剑逍遭苤塞堇鲞塑建缱堕筮蕉抚匿羞爰壹述蕉固遁壅!旦塑垒塞廛箜!塑中国图书分类号R328文献标识码A文章编号1000-4s4x{20lo)01．0061．05[摘要]目的：构建结核分枝杆菌H37Rv与H37Ra的差异表达基因消减文库，分离结核分枝杆菌差异表达cDNA片段。方法：利用抑制性消减杂交技术分析结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因组mRNA的表达差异，并进行两轮消减杂交和两次PCR，将第二次PCR产物与pGEM-T载体相连，电击转化大肠杆菌E．coliDH5a进行文库扩增和蓝白斑筛选，RT-PER鉴定差异表达文库。结果：以结核分枝杆菌强毒株H37Rv的cDNA为检测子的正相杂交和以弱毒株H37Ra的cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到选择性扩增，成功构建了差异表达cDNA文库A库和B库。所长出的菌落中90％为白色克隆，其中单一条带的克隆占75％和80％，片段大小集中在100～800bp之间。结论：利用SSH技术成功构建了结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差异表达基因消减cDNA文库，该消减文库的建立为进一步筛选、克隆这两种菌株之间差异表达的新基因奠定了基础。[关键词】分枝杆菌，结核；抑制性消减杂交；cDNA文库ⅡuMedicine，theMedical[Abstract]Objective：Tohybridization(SSH)．Methods：Weandreaction(H37Rvtester)andreaction(H37Ratester)，the75％and[KeywordsJXian·Zhi．DepartmentSecondHospital，ChongqingUni—versity，Chongqing400010，Chinahybridization(SSH)tobetweeninsertedscreenedclonesasconstructed．90％ofclones，thebandcoloniesWas80％．Conclusion：Thelibrariessuccessfullyconstructedsubtractivehybridiza．①本文为国家自然科学基金资助项目(No．30872261)作者简介：刘艳群(1974年一)，女，硕士，主要从事结核与免疫方面研究；通讯作者及指导教师：杜先智(1964年一)，男，教授，硕士生导师，主要从事结核病防治方面的研究，E—mail：dx甜一isolateMycobaeteriumH37RvH37Raespecially，andusingsubtraefiveusedsubtraetiveclonethedifferentialgenomicMyeobacteriumvirulencestrainattenuatedH37Ra．Aftertimeshy·bfidizationPCR，theproductslastPCRamplificationintopGEM-TEasybetransformedE．eoliDH5abluewhitetransformants．Thei—denfifiedRT-PCR．Results：HJ【gh