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中华肿瘤防治杂志２０１１年５月第１８卷第１０期ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶＴＲＥＡＴ，Ｍａｙ２０１１，Ｖｏｌ．１８Ｎｏ．１０·７４１·

前沿报道／论著
ＦＡＮＣＦｓｈＲＮＡ质粒构建及其对卵巢癌细胞
ＯＶＣＡＲ３沉默效应的观察

郝俊莹※，孙海刚※，李娜，余涧坤，唐宏涛，李艳琳，
于兆进，赵琳，何苗，魏敏杰
中国医科大学药学院药理教研室，辽宁沈阳１１０００１

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｓｈＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇＦＡＮＣＦｇｅｎｅａｎｄ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｏｖａｒｉａｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓＯＶＣＡＲ３

犎犃犗犑狌狀狔犻狀犵※，犛犝犖犎犪犻犵犪狀犵※，犔犐犖犪，犢犝犑犻犪狀犽狌狀，犜犃犖犌犎狅狀犵狋犪狅，犔犐犢犪狀犾犻狀，犢犝犣犺犪狅犼犻狀，
犣犎犃犗犔犻狀，犎犈犕犻犪狅，犠犈犐犕犻狀犼犻犲
犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犺犪狉犿犪犮狅犾狅犵狔，犘犺犪狉犿犪犮狔犆狅犾犾犲犵犲狅犳犆犺犻狀犪犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犛犺犲狀狔犪狀犵１１０００１，犘．犚．犆犺犻狀犪

【摘要】目的：构建针对人ＦＡＮＣＦ基因的特［犃犅犛犜犚犃犆犜］犗犅犑犈犆犜犐犞犈：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ
异性ｓｈＲＮＡ真核表达载体，体外观察ｓｉＲＮＡｏｆＦＡＮＣＦｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉＲＮＡｏｎｔｈｅｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ
对卵巢癌ＯＶＣＡＲ３细胞系ＦＡＮＣＦ基因的沉ｌｉｎｅｓＯＶＣＡＲ３，ｔｈｅｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
默效应。方法：采用基因克隆技术，将设计合成ｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．犕犈犜犎犗犇犛：ＴｈｅＦＡＮＣＦｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｅｄ
的能表达短发夹ＲＮＡ的寡核苷酸序列插入真ｈａｉｒｐｉｎｓｈＲＮＡｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＳｉ
核表达质粒载体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ４．１ＣＭＶｎｅｏ，构建ｌｅｎｃｅｒＴＭ４．１ＣＭＶｎｅｏ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔ
能表达ＦＡＮＣＦｓｈＲＮＡ的真核表达载体；转ｅｄｉｎｔｏｔｈｅｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓＯＶＣＡＲ３ｂｙＬｉ
染人卵巢癌ＯＶＣＡＲ３细胞，提取总ＲＮＡ和蛋ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００．ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃ
白，ＲＴＰＣＲ验证ｍＲＮＡ表达的变化，蛋白质ｔｅｄｂｙＲＴＰＣＲａｎｄｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．犚犈犛犝犔犜犛：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｎ
印迹法验证蛋白表达的变化。结果：质粒酶切ｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｐｒｏｐｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ
和测序证实成功构建了ＦＡＮＣＦｓｈＲＮＡ的真ｓｈＲＮＡａｍｏｎｇｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．Ｃｏｍｐａｒｄｗｉｔｈ
核表达载体。与野生型ＯＶＣＡＲ３相比，脂质ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄａｎｄｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｕｐｓ，ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘ
体法转染卵巢癌ＯＶＣＡＲ３细胞后，ＦＡＮＣＦｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦＡＮＣＦｇｅｎｅｏｎｔｈｅｏｖａｒｉａｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ
ｍＲＮＡ２４、４８和７２ｈ的表达水平与阴性控制ＯＶＣＡＲ３ｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００
组比较均下调，抑制率分别为（２３．９１±ｗｈｉｃｈｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔＴｈｅＦＡＮＣＦｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｅｄｈａｉｒｐｉｎｓｈＲＮＡ
６．５８）％、（５１．２３±５．８６）％和（４７．４２±７．５２）％；ｃｏｕｌｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦＡＮＣＦｇｅｎｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ
ＦＡＮＣＦ蛋白在２４、４８和７２ｈ的表达水平与阴ｗｉｔｈｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｕｐｓ，ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｄｅｃｒｅａｓｅｄ
性控制组比较亦下调，抑制率分别为（１６．２８±（２３．９１±６．５８）％，（５１．２３±５．８６）％，（４７．４２±７．５２）％２４，４８，
５．４６）％、（２４．４２±６．８５）％和（３６．０５±８．２６）％。７２ｈａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｒｅｄｕｃｅｄ
证实ＦＡＮＣＦｓｈＲＮＡ具有沉默ＯＶＣＡＲ３细胞（１６．２８±５．４６）％，（２４．４２±６．８５）％，（３６．０５±８．２