乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR.doc

乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR

[目的要求]
掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析

了解核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。
[教学时数]
讲授2学时，实验6学时。
[讲授内容]
血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作
[实验内容]
分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结
[自学内容]
“感染性疾病的分子诊断”

实验指导（自编）

实验乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR
【原理】
RealtimePCR是普通PCR的一项改进，使用了针对扩增DNA的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它已逐渐代替了Northernblotting以及semiRT-PCR技术。
本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术,利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针,实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。
TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。
图4：TaqMan荧光探针技术原理
R:荧光报告基团Q：荧光淬灭基团
【试剂与器材】
1．HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。
2．荧光定量PCR仪
3．PCR反应管
4．移液器及移液器吸头
5．高速离心机
6．漩涡混合器
7．超净工作台
8．调温电热板
【操作步骤】
1.试剂和主反应混合物的准备：从试剂盒中取出HBVPCR反应液、Taq酶及UNG。室温融化后，2000rpm离心10sec，设需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管室内质控+1管试剂空白+4管阳性参控品），40ul测试反应体系配制如下表：
试剂PCR反应液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反映管中分别加入38ul，转移至样本处理区。
2.样本的制备和上样
（1）标本处理
取n个0.5ml灭菌离心管，做好标记。首先加入100ulDNA提取液1，再分别加入待测血清或血浆样本（切勿吸入血细胞）以及各种对照品各100ul，振荡混匀，13000rpm离心10min：吸弃上清（离心时注意固定离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec（沉淀无需打散、混匀），100℃干浴，13000rpm离心10min，保留上清备用。如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃。
（2）上样
若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min。在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和室内质控血清、灭菌去离子水以及阳性参控品各2ul，盖紧PCR反应管管盖，并记录样本信息。
3.PCR上机扩增
检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器；检查并消除反应管底气泡。按设置装载反应管，选择或设置扩增和检测条件：选择预设的程序文件或设置为：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40个循环，荧光信号收集设在600C。设置模板：设置孔位及荧光（详见相应仪器的操作手册）。保存数据文件并运行。
4.结果分析
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