cDNA-AFLP分析大豆与尖孢镰刀菌互作中基因表达图谱.pdf

eDNA．AFLP分析大豆与尖孢镰刀菌互作中基因表达图谱学位论文刘喜梅导师姓名：许艳丽教授申请学位级别：农学硕士专业名称：植物病理学论文提交日期：2006年4月17日答辩日期：2006年6月14日所在单位：东北农业大学学位授予单位：东北农业大学学位授予日期：答辩委员会主席：赵奎军教授国内图书分类号国际图书分类号2006年6月20日密级：编号：303055
摘要大豆根腐病(Soybeanrot)是一种分布广、危害严重和防治较困难的世界性病害。近年来随着大豆面积的不断增加，大豆重迎茬状况日益加剧，使大豆根腐病的危害逐年加重，对产量的影响越来越大。尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是大豆根腐病的主要致病菌。关于大豆根腐病的研究多集中于病理学方面，大豆与尖孢镰刀菌互作分子机制未见报道，但是理解二者间的分子互作机制有助于对大豆根腐病的研究和防治。本试验就是从转录水平研究大豆与尖孢镰刀菌的互作机理。本文以cDNA．AFLP技术研究大豆与尖孢镰刀菌亲和性互作中大豆的转录图谱。用浸根法接种尖孢镰刀菌于大豆根部，以未接种的大豆根作为对照。分别在互作Od、2d、4d和8d后剪取接种和未接种的大豆根，然后提取大豆根部总RNA和mRNA，并将其反转录成cDNA后进行AFLP(amplifiedpolymorphism)分析。cDNA-AFLP操作中选择识别6个碱基位点的Asel和识别4个碱基位点的TaqI对双链cDNA进行限制性酶切，得到的两种粘末端分别连接上两种人工接头，预扩增～次后再用64对2+2选择性引物扩增并在聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染方法染色进行指纹图谱分析。结果表明：凝胶电泳显示的条带可分为4类：①在整个侵染过程中一直存在，而且未接种植物中也存在，这些片段是来自于植物。②一些片段在接种0-4d内处理均出现，在接种后8d表达量下降或不表达，而在对照中一直表达；还有一些在接种0天的处理中出现，在接种2-8d内表达量下降或不表达，而在对照中一直表达，这些片段可能是来自于植物。③一部分片段在接种Od的RNA样品中存在，在接种2．4d后消失，然后又开始积累，这些片段可能来自于尖孢镰刀菌；还有一部分条带只有在侵染后期才出现，这些片段大部分可能来自于病原菌，还有一些是来自于植物。这些来源于植物的基因一部分可能是由于受到尖孢镰刀菌的侵染而被诱导表达。④大豆在被尖孢镰刀菌侵染过程中没有出现，而在对照中出现的条带。这些基因可能是因为尖孢镰刀菌产生抑制子而抑制其表达。经分析后共获得差异片段16条，其中属于上调的有9条，下调的有7条。16条差异片段均送到生物公司测序。8条片段在数据库中找到同源序列，其中6条是已知功能的基因片段，其余的10条功能未知。序列同源性分析表明：s一7与大豆种衣BURP区域蛋白1基因有84％同源性；S-5与编码菜豆钙调素结合蛋白的基因有86％的同源性；S．19与白羽扇豆羟基多花碱一羟基烷宁转移酶有80％同源性，对S-5进行克隆并获得重组质粒。本研究首次将cDNA—AFLP技术应用于大豆与尖孢镰刀菌亲和性互作中差异表达基因研究，并对其加以改进，成功分离到与大豆感病相关基因差异表达片段。由于这些发生表达变化的基因很可能参与互作过程，所以本文研究的结果有助于揭示尖孢镰刀菌侵染大豆过程的分子机理和基因基础。关键词：大豆；尖孢镰刀菌；差异表达：cDNA．AFLPfragmentlengthroot
GeneExpressionF．oxysporumeDNA-AFLPAbstractProfilingofduringInteractionsSoybeanandusingplant．②Somemajoradjustedtypes：①time-course．③inferred．Whilstinfection．④Someconsideredproductionwhichpathology．MolecularmechanismFunderstandingdifferentiallydippedisolated．Double-strainedtranscriptaseII．Specificallydesigned20一folds5％polyacrylamideunaffectedinfromdayWaSconstraintsoybeanworldwide．Endangermentwasincreasinggraduallyalongwiththeincreasecultivationarea，especiallycontinuouscultivation．Fusariumoxysporummainpathogenrot，ofresearchfocuredinteractionbetweenhasbeenreportedyetwouldhelp