双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立.pdf

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双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立鳖墅匿堂!塑!生箜!!鲞箜!塑坐!型!翌丛!!!!i些!塑!：!!!!Q：堕!!：(同济大学附属同济医院检验科，上海200065)作复杂，仍不适用于临床。因此我们根据ESBLs以及AmpC酶的生化特性，建立了一种简便易行的检杆菌AmpC酶的筛选方法。s能够水解广谱青霉素类、头孢菌素类(包括第三代头孢菌素)及单环类抗生素，但对头碳青霉烯类无明显作用，酶活性可被克曲南或CLO抑制，对碳青霉烯类较敏；对阴沟肠杆菌，CAZ诱导产生AmpC酶的而FOX诱导产生AmpC酶的能力强∞J。们选用CAZ(或CTX)、FOX、FOX／CLO、(或CD03)、CAZ(或CTX)／CLO、CD02(或)／CLO及IPM设计了一种能同时检测s和AmpC酶，并能分辨所产AmpC酶是诱导持续高产的试验——DDIST，试验纸片我们用该法分析了华山医院收集到的58株菌临床菌株产生AmpC酶的情况，并用三维试验进行验证。试验以ATCC对照。图1为阴沟肠杆菌中几种典型的了FOX杀灭试验菌株能力，即细菌产生C酶，同时纸片3、4分别比纸片1、2的抑杀灭试验菌株的能力，CAZ是不良的酶诱导剂，图1b表明细菌产生的为持续高直径增大显著差别，IPM诱导产生了AmpC酶使CAZ、为诱导型AmpC酶，由于1194E是高诱准菌株，IPM是最强AmpC酶诱导剂，所以本研究认为诱导产生的酶量超过了CLO的抑强AmpC酶诱导剂，使得纸片2抑菌圈差别，表明存在诱导剂时(FOX、CLA、产生AmpC酶，无诱导剂时则不产生AmpC4由于克拉维酸诱导产生的AmpC酶被涂少华，叶元康，沈昭在测阴沟肠霉素类和拉维酸抑制；AmpC酶不受克拉维酸影响，可为低浓度的氨感¨’2能力弱，因此，我产生还是之间的距离为25阴沟肠杆、1194E以及ATCC700603分别作为产酶阴性、阳性酶产株在DDIST中的表现，(1)图1b：纸片6比纸片5抑菌圈直径增大4mm以上，表明CLO明显增强了Amp菌圈直径增大5mm以上，表明CLO还能明显增强CAZ产型AmpC酶；(2)图1c：纸片6比纸片5抑菌圈mm以上，纸片1、2、3、4的抑菌圈无的抑菌圈呈刀切样缩小，数项特征均表明菌株产生的导酶的标制能力造成纸片3、4仍呈刀切样；(3)图1d：克拉维酸是直径反而小于纸片1，同时纸片6比纸片5抑菌圈直径增大5mm以上，纸片3与纸片1的抑菌圈直径无IPM)酶，纸片摘要：目的建立检测肺炎支原体(MP)抗原的双抗体夹心囊蠢墼葡{涮壕湍l¨型囊辇i：垂蓄曼篓荔驻錾多曩翮秘羹：霁到型刚刚鎏≈斋费蓍驯i萝篓霎博爱鬻搴≯妻曩冀l蠢|璧奏吲螋j霎萋荔髯副剥上妻耄菇型薹妻荫牮去翼饕。买囊鍪萎塞霉囊i主霎熏霪囊鍪羹蒜型誊翘：n誊戡鬟雾雾憾蠢蓊摹鑫篓蠢冀蓄驰孽蠢萋蠢雾蛆妻羹囊副囊篓离鬈；晕奏翼!露骨荔龇型刖i囊薹鬻缈囊薹鐾囊芝茎≥时军i；羹薰l萋摹囊i；蓄霪雨揭堀i篓堍羹菩羹羹薹薯墓冀钟文章编号：1001-2087(2005)03_0214．03中图分类号：R375文献标识码：AESBLCD02CD03mm。25922、029、029MAmpC4o
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故建立双抗体夹心ELISA敏感度为2彬Illl，见捡鲎堡堂婴!生筮丝鲞筮!塑地!堕塑坠堕鲤竺垫堕!!型丝：丛!：养基颜色由红变黄后，以12纯化MP膜结合蛋白抗原(43二、MP单抗制备及纯化用MP膜结合蛋白抗原制备MP单抗。将2株针对不同抗原决定簇的MP单抗589、4D6杂交瘤腹水提取液，按硫酸铵盐析法和DEAEpH7．0的PBS洗脱，收集单抗，用紫外吸收法测定纯化后2株单抗的蛋白含量，用免疫荧光法(IFA)测定抗体的效价心1。使用辣根过氧化物酶(HRP)，采用过碘酸钠法标记MP单抗(4D6)，按文献[3]操作进行。四、选择包被抗体和酶标记物的工作浓度采用方阵滴定法，将589单抗按不同稀释度oC过夜，次日用2％的酪蛋白37。Ch，PBS—T洗涤3次，加制备好的MP抗原，min，再洗涤3次，然后加不同稀释度的酶标抗体，37。c作用30底物显色，以PBS液作阴性对照，酶标仪450测定吸光度(A)值，确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度。五、敏感性和特异性的检测PBS稀释成不同浓度，包被抗体和酶标抗体采用最佳工作浓度，观察双抗体夹心ELISA和PCR在不同MP抗原浓度的反应结果，用解脲脲原体、口腔支原体、猪鼻支原体、精氨酸支原体、莱氏胆甾支原体、鸡毒支原体、鸡滑膜囊支原体及生殖支原．体进行MP单抗特异性检测。参照文献[4]以16srRNA为靶基因的引物，科学院上海生物工程技术服务有限公司合成。50斗l反应体系：模板5山，上下引物各5¨mol／L，2肛l，10倍浓度的反应缓冲液5出，Taq酶min，共25个循环，循环结束后72。c再延伸10m