具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选.pdf

第21卷第1期台湾海峡Vol.21,No.1
2002年2月JOURNALOFOCEANOGRAPHYINTAIWANSTRAITFeb.,2002

具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选X

李根1,陈瑞川2,林昱1
(1.国家海洋局第三海洋研究所海洋生物工程重点实验室,福建厦门361005;
2.厦门大学抗癌中心,福建厦门361005)

摘要:本研究采用MTT法对海洋放线菌、细菌、霉菌及极地和大洋细菌进行细胞毒活
性物质的筛选,结果有10%放线菌及一株极地细菌具有细胞毒活性.此外利用DNA
修复特性在E.coli343/591和E.coli343/636之间的差异性,对前面筛得的菌株进
行DNA损伤的筛选,结果得到两株活性菌株.采用荧光染色观察得到3株具有诱导
肿瘤细胞凋亡的菌株,这些具抗肿瘤活性的菌株可供进一步研究.
关键词:MTT分析法;DDRT法;细胞毒活性物质;细胞凋亡
中图分类号:Q7文献标识码:A文章编号:100028160(2002)0120018205

近年来,国内外在海洋生物抗肿瘤活性物质筛选和研究上已取得了初步的成果.NCI每年
筛选的3万个新的抗肿瘤化合物中,约有5%来自海洋生物;业已证实,约10%的海洋动物提
取物有抗P388白血病细胞及KB细胞活性,3.5%的海洋植物提取物有抗肿瘤活性或细胞毒
活性[1].这些化合物绝大多数具有独特的化学结构和明显的抗癌、抗病毒作用,主要包括生物
碱、多肽及蛋白质、萜类、大环内酯类、多糖类、脂类等,其作用机理亦呈多样性,有以影响
DNA、RNA、蛋白质为主的,也有以干扰有丝分裂或诱导细胞内信息分子的改变为主的,通常
这些活性物质作用浓度甚微,而且毒副作用较低[2].
目前,国内外寻找海洋药物的研究对象主要是海藻和海洋动物,据报道,到目前为止已成
功地分离到5000多种具有生物活性的海洋天然产物,但由于其含量低,生物量有限,分离提
取的生产成本较高,使得许多研究成果的应用推广受到限制.因此,人们把注意力转向海洋微
生物的培养与发酵技术以及其代谢产物的研究上.由于海洋微生物所处的海洋环境是十分独
特的,海洋微生物是产生新的生物活性物质极好来源之一.同时海洋微生物的特点是繁殖快、
易培养等,可以结合现代发酵工程技术,使之工业化生产,降低海洋药物的生产成本[3].本文
以MTT法、DDRT法及荧光染色法对从极地、大洋、近海大量分离得到的放线菌、细菌和霉菌
进行抗肿瘤活性物质的筛选.
1材料与方法
1.1细胞株及试验菌株

X收稿日期:2001210217
基金项目:由科技部基础性工作项目《海洋药源生物种质资源和基因库的构建》和国家海洋局海洋生物工程重点实验
室研究课题资助(NoHY9903)
作者简介:李根(1978～),男,在读硕士研究生.

©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.
1期李根等:具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选·91·

细胞株人胃癌细胞MGC8023,由厦门大学抗癌中心提供.
试验菌株343/591为赖氨酸和生物素营养缺陷型并具有发酵乳糖能力和DNA修复缺
陷的uvrB/recA菌种343/636为不能发酵乳糖的脯氨酸营养缺陷型菌株并具有紫外线损伤和
DNA修复能力,购自上海医药工业研究院.
1.2待筛菌株
363株海洋放线菌,70株极地及大洋细菌,234株海洋细菌及26株霉菌,均由本实验室分
离保存.
1.3细胞培养
人胃癌细胞MGC8023于含10%小牛血清、100U/cm3青霉素、100μg/cm3链霉素及50
3
μg/cm卡那霉素的RPMI1640培养液中,在37℃,5%CO2及饱和湿度环境下培养、传代.
1.4菌株发酵及发酵液的预处理
菌株接种于发酵培养基,经2d活化后,补加培养基,28℃摇床培养至对数生长期后期(细
菌3d、放线菌约5d).发酵结束后,将发酵液转移至10cm3的管子中,超声波破碎2min,
104r/min离心10min,小心吸出上清液.上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,分装于小管
中,于-20℃冻存,使用时以RPMI1640培养液作适当稀释.
1.5MTT分析法
根据文献[4]作适当修改,步骤如下:
细胞培养至90%铺底(处于对数生长期),用胰酶消化液(0.25%胰酶/D2Hank’s液)消化
收集细胞,吹打制成单细胞悬液,苔芬蓝染色计算活细胞数,接种细胞于96孔板中,每孔加
3
200mm悬浮细胞液,在37℃CO2培养箱培养过夜.第二天加入各稀释度的菌株发酵液
20mm3,继续培养3d,倒去培养液,PBS洗1遍,加入MTT(0.2mg/cm3)100mm3,在37℃培养
4h,然后去除MTT,加DMSO与甘氨酸