PCR原理-PPT0.ppt

变性与复性DNA的变性(denaturation)：解链温度（融解温度，Tm）(meltingtemperature)：增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。DNA的复性（renaturation)：减色效应：
变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。1.常用的变性方法：2.影响复性的因素PCR技术总论聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称TaqDNA聚合酶。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。PCR基本原理PCR原理PCRproductPCR反应曲线标准的PCR反应体系PCR反应五要素引物引物设计的原则（一）引物设计的原则（二）引物设计的原则（三）引物设计的原则（四）酶及其浓度dNTP的质量与浓度模板（靶基因，targetgene）模板（靶基因，targetgene）Mg2+浓度PCR反应条件的选择温度与时间的设置：①变性温度与时间：②退火(复性)温度与时间：引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：③延伸温度与时间：③延伸温度与时间：循环次数PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低热启动PCR
Touch-downPCR
RT-PCR
兼并引物PCR
巢氏PCR
反向PCR
不对称PCR
原位PCR
连接酶链反应
RACE-PCR
AFLP
免疫-PCR(immuno-PCR)
MSP甲基化特异PCR1）不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；
基因组DNA结构功能的研究2)反向PCR(reversePCR)3）多重PCR（复合PCR）4）LP-PCR（Labelledprimers)5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）6）PCR固相分析法7）原位ＰＣＲ操作步骤
1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2.PCR扩增细胞内目的片段
3.原位杂交检测扩增产物8）ＲＴ－ＰＣＲ9)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪什么是测序？Sanger第一步：加入复制终止剂Sanger第二步：荧光检测Shotgun测序Shotgun测序（2）——拼接错误：Repeat的存在基因的概念
经典遗传学中基因的概念

孟德尔称控制性状的因子为遗传因子
1909年约翰生提出了基因这个名词，取代孟德尔的遗传因子
→摩尔根等人对果蝇、玉米等的大量遗传研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学

经典遗传学认为：基因是遗传上最小的结构与功能单位，不能分割。是结构与功能的统一体分子遗传学中基因的概念
基因的本质：
（1）基因是特定长度和碱基序列的DNA片段
（2）核苷酸序列中蕴藏着遗传信息：

mRNA多肽
DNAtRNA
rRNA

调节基因
基因的功能类型基因的几种特殊形式(3)断裂基因或隔裂基因(4)跳跃基因(jumpinggene)