T细胞表型及脾细胞分离.ppt

研究生实验实验一、T细胞表型测定（一）---免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存T细胞共有标志：CD3+为总细胞
T细胞特有标志：CD4+细胞为辅助细胞，
CD8+细胞为杀伤细胞。正常值：T淋巴细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能，对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。SABC-AP法测定T细胞亚群Tcell实验材料实验步骤标本制备：淋巴细胞悬液的制备标本染色注意事项：观察结果注意事项：实验二小鼠脾细胞分离与制备技术实验材料：选择小鼠，拉脱颈椎处死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪开皮肤，打开腹腔。找到红色的脾脏，用镊子分离后摘除。
将脾脏放入盛有5-10ml培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组织。
将脾脏移入另一个盛有5-10ml培养液的平皿中，轻轻漂洗后置于100目细胞筛中，轻轻挤压使脾细胞通过筛孔进入培养液中，反复冲洗，以取得脾细胞悬液。收集分离出的脾细胞，置于10ml离心管内加入培养液吹打，取10μl细胞，与10μl胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力，同时进行细胞计数。
细胞活力观察（台盼蓝染色）：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，被染成淡蓝色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与活细胞。
细胞计数：采用细胞计数板。材料：4%台盼蓝母液（称取4g台盼蓝，加蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4%）、血细胞计数板、显微镜等。
步骤：①制备单细胞悬液；②染色：取10μl细胞悬液与10μl台盼蓝溶液并混匀；③计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞。
注意事项：台盼蓝对人体有毒，尽量避免直接接触。染色时间不宜过长，否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。细胞计数：实验报告