正确制作使用猪自家疫苗技术.doc

正确制作使用猪自家疫苗技术
内容简介：当前某些疾病的暴发使得国内市场上还没有针对该疾病的确切免疫保护效果的商品疫苗供应，因此为了挽救不可估量的经济损失，有的猪场使用自制自家疫苗免疫。
近年来随着我国HYPERLINK"http://www.1350135.com/html/hangqing/shengzhujiage/"\t"_blank"生猪养殖规模和养殖数量的增加，引进的外来品种越来越多，市场的流动性增大，各养殖HYPERLINK"http://www.1350135.com/html/yangzhujishu/yangzhuchang/"\t"_blank"猪场在消毒、防疫、治疗措施等方面也存在很多空白的地方，造成现在各种猪病的广泛发生和传播，也使得当前猪病的特点呈现多样化和复杂化。当前某些疾病的暴发使得国内市场上还没有针对该疾病的确切免疫保护效果的商品疫苗供应，因此为了挽救不可估量的经济损失，有的猪场使用自制自家疫苗免疫。尽管有关专家呼吁不能长期或随意使用自家疫苗，但自制自家疫苗还是经常被用来在特定时期救急，提醒广大养殖朋友对于自家苗一定要正确制作、谨慎使用。
1、材料与方法
1.1.仪器设备：
37℃恒温培养箱、洁净组织搅碎机、解剖刀、电子天平、烧杯、绞肉机、不锈钢圆盘、量筒、玻璃棒、漏斗、灭菌纱布、100毫升灭菌疫苗瓶、干热高温灭菌箱、无菌操作台、酒精灯、灭菌平皿、EP管架、移液器及其灭菌枪头、镊子、接种环、摇菌床、瓶盖封口机、灭菌移液管(10毫升)、250毫升细胞瓶、酸缸、吸耳球、C02培养箱、倒置显微镜、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、匀浆机等。
1.2材料试剂生理盐水、蒸馏水、甲醛溶液、症状典型的病料、TSA、TSB、DMEM(营养液含10%小牛血清和氨基葡萄糖、维持液含2%小牛血清)、PK-1.5细胞、双抗(青、链霉素)、胰蛋白酶等。
1.3自家苗制作
1.3.1自家组织苗制作选取患有典型症状且没有用抗生素治疗的病猪，用解剖刀宰杀放血，剖开胸腹部，选取肺脏、脾脏、淋巴结(主要是腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结)等器官作为主要病料，如果肝脏和肾脏病变较明显，也可选取病变明显部位作为辅助材料，但要尽量保证病料的新鲜，防止其他杂菌污染，以确保组织苗的效果。如果不能及时处理病料，则需要把病料密封好放在-80℃低温处保存。将选取的病料放在已灭菌的绞肉机中绞2～3次，试估计其重量。取相当于病料重量25%～35%的生理盐水加入病料中混匀，放人组织捣碎机中捣碎.12000转/分钟捣碎约2—3分钟，将捣碎的病料放入不锈钢圆盘中密封，最后放人冰箱中冷冻，完全冻结的病料取出后溶解，如此反复冻融三遍，再将解冻的病料与生理盐水按1千克：3500—4000毫升的比例进行稀释调兑，之后用双层无菌医用纱布过滤，然后将过了两层纱布的滤液再过两次四层纱布，最后所得滤液中加入0.8%的甲醛，一小时摇匀后，置37℃恒温箱中灭活，灭活时间不能太短。灭活期间，每4～6小时摇动一次约半小时，48小时后灭活完毕，分装前按1500国际单位/毫升比例加入双抗(青霉素和链霉素)，另外还可加入一定量的黄芪多糖并摇匀，以增加猪只抗体的生成，再移至无菌操作台中无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃~8℃下保存待用。
1.3.2自家细菌苗制作
取本场患有典型症状且未用抗生素治疗过的病猪，放血解剖，取猪体肺脏、脾脏、猪脑积液或患有关节炎的猪腿关节液于无菌操作台上接TSA平板。若无备用TSA固体平板，先密封病料于-20℃低温保存，并立即以蒸馏水和TSA粉末按24：1的比例调配TSA溶液并于114℃下灭菌16分钟，之后在水浴锅内冷却至45℃左右时于无菌操作台上加入5%的无支原体小牛血清和0.15%的NAD并摇匀，同时倒制无菌TSA平板冷凝待用。接菌的平板于37℃恒温培养箱下保持生长约18小时左右直至菌落形成，观察菌落形态并进行细菌纯化、生化鉴定和革兰氏染色。据统计，当前临床猪细菌病当中主要以副猪嗜血杆菌、链球菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌等的原发或继发感染为主。TSA固体平板上鉴定纯化的细菌用TSB液体培养基洗下作菌液并转于500毫升葡萄糖瓶内的300毫升TSA液体培养基内37℃摇菌扩大培养约18小时，其中TSB液体培养基以蒸馏水和TSB粉末按33：.1的比例调配并于114℃灭菌16分钟，冷却后再加入1.2‰的NAD。扩大培养的细菌再以0.8%甲醛于37℃下摇床摇菌灭活20小时左右，灭活的细菌再接TSA平板37℃恒温培养18小时左右，根据平板上的细菌生长情况判断细菌甲醛灭活是否彻底。同时进行细菌计数和细菌浓缩，以判断抗原量和提高抗原量，若抗原量过大，可用灭菌生理盐水稀释。当验证已灭活彻底且抗原量达标的细菌方可于无菌操作台内无菌分装于1