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光合细菌的分离及初步鉴定

【摘要】利用从西南大学北校区崇德湖的边泥，富集分离得到两种光合细菌，该菌株厌氧培养后呈现出红色和绿色，革兰氏染色呈阴性，通过形态学观察及文献资料查询鉴定，初步鉴定为该菌株属于红假单胞菌属和蓝细菌。

【关键词】光合细菌富集分离鉴定

目的
初步了解无氧操作，学会无菌操作和革兰氏染色，掌握微生物实验的基本技能，学习分离厌氧光合细菌及初步鉴定的方法。
原理
光合细菌在有光照缺氧的环境中能进行光合作用，利用光能进行光合作用，利用光能同化二氧化碳，与绿色植物不同的是，它们的光合作用是不产氧的。光合细菌在自身的同化代谢过程中，又完成了产氢、固氮、分解有机物三个自然界物质循环中极为重要的化学过程。
从厌氧且能得到光照的环境采样，选用特定的富集和分离培养基，在厌氧并有光照的条件下进行培养，可分离到不同的光合细菌。
材料与用具
1、材料崇德湖池塘边透光处采取淤泥
2、培养基及试剂
光合细菌液体富集培养基（以下配方为500ml所用）：
CH3COONa1.5g；CH3CH2COONa0.15g；NaCl0.5g；(NH4)2SO40.15g；MnSO412.5mg；K2HPO40.15g；KH2PO40.25g；CaCl20.025g；MgSO4•7H2O0.1g；FeSO4•7H2O0.0025g；酵母膏0.05g；蛋白胨0.005g；蒸馏水500ml；pH7．0
光合细菌分离培养基（以下配方为500ml用）：
CH3COONa1.5g；CH3CH2COONa0.15g；NaC10.25g；NH4CI0.5g；MgSO4•7H2O0.1g；K2HPO40.15g；KH2PO40.25g；CaC120.025g；MnC12•4H2O0．0015g；FeSO4-7H2O0.0025g；酵母膏0.05g；蛋白胨0.005g；谷氨酸0.0001g；蒸馏水500ml；琼脂10g；pH7.2—7.4
无菌水、无菌液体石蜡
3、仪器及用具光照培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、三角瓶、培养皿、试管、接种环、接种针、玻璃珠等。
操作步骤
（一）采集含菌样品从崇德湖湖边某向阳处挖取淤泥。
（二）培养基的制作按照给出的配方配制培养基。
（二）富集培养取已经灭菌的200ml的光合细菌液体富集培养基，加入少许玻璃珠，同时接入泥样10g，振荡混匀，液面注入0.5cm高灭菌液体石蜡，棉塞封口，造成厌氧环境。在温度28℃、光照5000lx的生化培养箱中培养至培养液呈红棕色，并且在瓶底淤泥表面有深红色沉积物，使欲要分离的光合细菌成为优势种。
（三）多次富集取适量经初步富集的菌液于试管液体富集培养基中，再次富集，重复两次，使光合细菌进一步繁殖增多，成为绝对优势种。
（四）光合细菌的分离①采用混菌法，在无菌培养皿上滴加1ml富集培养液，然后倒入一层厚厚的分离培养基(融化后的培养基应冷却至50℃后再覆盖)，混匀后置于光照培养箱中继续培养分离，直至得到纯的单个菌落。
②采用双层平板划线法和双层平板涂布发，即先在无菌培养皿上倒一层培养基，然后涂布和划线菌液，再在其表面倒一层培养基，形成无氧环境。继续培养至出现单菌落。
待单菌落长出后，用穿刺法继续纯化目的菌，即用接种针在平板中挑取菌落为红色和绿色的菌落，插入培养基底部，继续培养后进行菌种鉴定。
（五）光合细菌的初步鉴定首先观察分离平板上生长的菌落形态及特征，对不同菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态特征。
五、实验结果
在富集培养基中，培养液刚开始逐渐成为红褐色，持续一段时间后变为绿色，并能看到明显的绿色藻状物。
分离培养基底部得到了两种厌氧菌落，一种为红色菌落，菌落表面微光滑、突起、湿润、有光泽、不透明，菌落边缘整齐，革兰氏染色表明该菌株为革兰氏阴性菌，光学显微镜下细菌形态为杆状，长明显大于宽。
另一种菌落呈绿色，表面光滑湿润，不透明，边缘整齐，革兰氏染色表明该菌株也为革兰氏阴性菌，光学显微镜下细菌形态为球状或链状。
实验结果分析
1、根据两种厌氧菌的形态观察和革兰氏染色结果，查文献初步判定红色菌落为红假单胞菌属，绿色菌落为蓝细菌，当然这只是初步的判断，还得经过系列实验才能得出具体结论，但由于实验条件有限，不能进一步鉴定其生理生化特征。
2、鉴于光合细菌能进行光合作用自养，因此所用培养基含碳源和氮源甚少，不利于大多数微生物生长，所以培养基中杂菌很少，只在分离平板表面上出现一种乳白色、湿润、凸起、呈浆状的杂菌。
3、在配置培养基的过程中遇到了麻烦，首次所配的液体培养基灭菌后出现了很多沉淀，猜想可能由于PH值未严格控制，或药品加入顺序不对，或各药品间会发生化学反应沉淀所造成，于是重配培养基，按要求调PH，查药品加入顺序，各药品先各自溶解再混合，但结果仍有沉淀，前后共配三次也未改变。不知原因出现在何