分子克隆载体.ppt

分子克隆载体基因工程的表达体系
操纵子理论在基因工程中的应用
目的基因翻译表达及其准确性
常用基因载体基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
常用的载体有质粒、噬菌体、病毒大肠杆菌表达体系的优点：
积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；
可因不同载体而选择不同菌种作宿主；
操作安全，致病能力低；
成本相对低得多；
真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。

操纵子理论在基因工程的应用操纵子二、强启动子的构建开始转录RNA转录起始TATA盒RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合诱导物标志补救（ß-半乳糖苷酶法）X-gal（LacZ基因N端序列）转录终止：非依赖ρ因子的转录终止需要茎环结构，以t（termination）代表。茎环结构使转录终止的机理

目的基因翻译表达及其准确性
核糖体结合位点（S-D序列）lF1、3
EcoRI如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列:
5’…ATGNATGNATG
5’…ATGNATGNATG123456
5’…ATGNATGNATGXY123456
5’…ATGNATGNATGZ123456
TAA常规质粒载体质粒(plasmid)
1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。

2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。

3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。

4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。
第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。
有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。

此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。普通型载体pBR322的结构图476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。

lacZ之内是M13的多功能连接器。三个显著特点：

（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。
（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用-互补原理进行蓝白筛选。
（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。

其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。pKO系列在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算启动子功能的强弱。
如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。λ噬菌体载体
噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。
入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖（图1-5