利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株.pdf

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005,13(5):672~678
·研究论文·
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利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌突变株
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熊伟1梁运祥1朱浩君1闵勇1吕和平2郑应华2*
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(1.华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉430070;2.北京生物医药研究所,北京100091)
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摘要：PCR介导的基因置换技术是一种利用噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方
姿
法快速构建基因中断载体,并成功地置换了阿维链霉菌()基因。先合成1对长度分别为58和59nt
的引物，其5'端的39nt序列分别与基因两侧同源，3'端则分别与安普霉素抗性标记盒(+oriT)两侧序列一致。
以该引物扩增的PCR产物电转化能表达Red重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌()菌株BW25113/pIJ790/
姿
pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4.0kb目的片段插入基因置换载体pHZ1351，再接合转
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移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为ApraRThioS的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接
合子为突变株。
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关键词：PCR介导的基因置换;Red重组;阿维链霉菌;支链酮酸脱氢酶基因();基因中断
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ConstructionofMutants
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UsingPCR-mediatedGeneReplacementMethod
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XIONGWei1LIANGYun-Xiang1ZHUHao-Jun1MINYong1LHe-Ping2ZHENGYing-Hua2*
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PCRmediatedgenereplacementmethodisanovelwayofgeneknockoutinbacteriawhichisbasedonRedsystem.
姿
Byusingthemethod,agenereplacementvectorwasrapidlyconstructedandthengeneofwassuccess-
fullyreplaced.Firstly,apairof58and59ntprimerswereprepared,whichhadat5'end39ntmatchingtheflankingsequenceof
,andthe3'sequencematchingtherightorleftendoftheapramycinresistantcassettes(+oriT).ThelinearDNA
PCR-amplifiedbytheseprimerswaselectrotransformedtothestrainBW25113/pIJ790/pXW1224whichexpressedRedenzymeand
姿
containedtargetplasmid,thenseveralpositiverecombinedplasmids(pXW1230)wereacquired.The4.0kbtargetfragment
域
frompXW1230wasinsertedintopHZ1351,andsubseqnentlyintroducedintoBJBM9903byconjugaltransfer.After
PCRandHPLCandMSanalysisoffermentationproduct,thescreenedApraRThioSconjugantwasconfirmedtobethemutant.
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PCR-mediatedgenereplacement;Redrecombination;;;genedisruption
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阿维链霉菌()是一种地研究其功能基因组奠定了坚实的基础。
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具有复杂形态分化的革兰氏阳性土壤细菌,它的次PCR介导的基因置换(PCRmediatedgenere-
级代谢产物之一阿维菌素(avermectin)是一组具有placement)是一种基于线性DNA分子高频转化微
相似结构的十六元大环内酯类抗生素,体外驱虫活生物细胞的新型基因中断方法。该法通过设计1对
性极强,在农业和畜牧业生产中具有广泛的应用5'端与目标基因同源(同源片段的长度30~60nt)的
(Burg.,1979)。目前，阿维菌素的生物合成基因长引物来扩增适合的选择性标记，并用该PCR产物
簇已被克隆(Ikeda.,1999),阿维链霉菌的全基直接电转化受体菌，根据同源重组的原理使之整合
因组测序也已经完成(Omura.,2001)，这为系统入染色体，从而置换掉原有的目标基因片段。目前，

熊伟:男,1980年生,硕士研究生。