第三章 抗体的制备与纯化技术.ppt

大家下午好！第三章特异性抗体的制备与纯化技术绪论第一节多克隆抗体的制备与纯化多克隆抗体（抗血清）的制备流程
抗原半抗原+载体
佐剂
免疫动物（3-5次）

测效价

动物采血，分离血清

抗血清纯化、鉴定、保存一、抗原制备2）可溶性抗原（3）蛋白提纯⑦其它（4）纯化抗原的鉴定3）半抗原2.佐剂
1）定义：与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫类型的物质.
2）良好的佐剂应当具备以下条件：
（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；
（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；
（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫；
（4）具有无毒性或副作用低的特点。
3）常用佐剂的种类和制备二、免疫血清的制备2、免疫方法3、免疫血清采集、分离及保存放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。琼脂板的制备：100mlpH7.1的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。2）抗血清的采集、分离和保存3）免疫失败的可能原因及应采取的措施三、抗体的纯化和鉴定硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用2次33%饱和度沉淀丙种球蛋白。
离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多种蛋白质，但不能吸附IgG.
亲和层析法：将纯抗原（或SPA)交联到Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱，特异性吸附IgG。
凝胶过滤法：分子筛层析
3、抗体鉴定四.多克隆抗体的应用与问题
一）应用
免疫学检测
被动免疫治疗和紧急预防
二）存在问题
特异性差,用于免疫学检测容易出现交叉反应

第二节单克隆抗体(Monoclonalantibody,McAb)BALB/c小鼠简介4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化
1）筛选：
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。2）克隆化有限稀释法克隆
（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。（6）8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。（8）每个克隆应尽快冻存。软琼脂培养法克隆（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞