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藻类叶绿素a的测定
一、实验名称
藻类叶绿素a的测定
二、实验目的——(水)环境化学中叶绿素a测定意义
在地表水环境的富营养化的研究中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的最常用的指标之一。同时，叶绿素a也是用来衡量水体水质，评价水体富营养化水平的标准之一。
三、实验原理叶绿素介绍
叶绿素是植物进行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。所有光合器官中都含有叶绿素。叶绿素a和b都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，难溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙红光和蓝光。因此，这两种光对光合作用最有效。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素不很稳定，光、热、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。在酸性条件下，叶绿素中的镁原子很容易被其他酸代替，绿色消失而变黄，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，加热时反应加速。
叶绿素的实验室测量方法有分光光度法、荧光法、色谱法，其中以传统的分光光度法应用最为广泛。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A=α•C•L
式中：α为比例常数。当溶液浓度以百分比浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
（1）单色法
已知叶绿素a的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm，已知在波长663nm下，叶绿素a在该溶液中的比吸收系数分别为82.04，因此CA=A663/82，可以计算出叶绿素a的含量(mg/L)。
（2）三色法
已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，且两吸收曲线相交于652nm处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的吸光值，根据经验公式便可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。
已知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：
A663=82.04Ca+9.27Cb………………(1)
A645=16.75Ca+45.6Cb………………(2)
式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程：
Ca=0.0127A663-0.00269A645…………(3)
Cb=0.0229A645-0.00468A663…………(4)
如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：
Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645…………(5)
Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663…………(6)
叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7)
叶绿素总量也可根据下式求导
A652=34.5×CT
由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数(均为34.5)，因此也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)求出叶绿素总量：
CT(g/L)=A652/34.5
CT(mg/L)=A652×1000/34.5………(8)
因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
从上可见，叶绿素提取后测定又可以分为两种：单色法(663nm)与三色法(645nm、663nm、652nm)。具体使用单色法还是三色法将依据测定对象而定。
在标准方法、超声波法、反复冻融法、延时提取法、热丙酮法、丙酮加热法、热乙醇法、混合溶剂法等多种常见浮游植物叶绿素a测定方法中，针对实验室培养的微囊藻（Microcystisaeruginosa）水华样品为研究对象进行的叶绿素a含量测定。不管是从叶绿素a提取的完全性、测定数据的稳定性、试验操作的简便性考虑等方面来看，包括国家标准方法在内的大多数方法，存在操作耗时长、过程复杂、叶绿素提取不完全的缺点；而以丙酮加热法测量叶绿素a的提取效率高、数据稳定性好，操作耗时短、简便，可推荐作为一种常用的浮游植物叶绿素a的测量方法，尤其是应急监测或大批量水环境样品测定时更显现优势(表1)。
表1不同提取方法实验耗时情况
测定方法标准方法延时提取法热丙酮法反复冻融法超声提取法丙酮加热法热乙醇法混合溶剂法ρ/(µg·L-1)0.9741.0111.2161.4