血液分离技术.doc

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第十八章血细胞分离技术
（Separationtechniqueofthebloodcell）

一、原理

在体外进行细胞免疫检测时，首先必须进行淋巴细胞的分离。分离淋巴细胞的方法很多，但不管采用哪种方法，均要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。
外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。红细胞的自然沉降率较快，加入高分子量的聚合物，如明胶、右旋糖酐等还可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度离心法或二者结合，可以将淋巴细胞从血液中分离出来。这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞。除去单核细胞，可以利用单核细胞的吸附功能，如铁颗粒、玻璃面或尼龙网等，除去（或分离）单核细胞，从而提纯淋巴细胞。

二、采血

（一）材料与试剂
1．抗凝剂
（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1000U/ml，市售肝素多为100U~126U／mg。
（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成4％的溶液备用。
（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：
枸橼酸钠（Na3C6H5O7·5H2O）0.80g
枸橼酸0.0325g
葡萄糖2.05g
氯化钠0.42g
H2O加至100.00ml
混匀溶解后，114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。
阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血细胞的保存液。
2．针头根据不同动物和采血部位，采用不同型号的针头，用前必须灭菌或消毒。
3．采血容器注射器或三角瓶等。
4．采血动物。
（二）操作方法
1．采血法各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。
2．抗凝采集血液最关键的问题是抗凝，采用什么方法进行抗凝，则根据实验的要求和条件而定。最常用的方法如下：
（1）肝素抗凝：采血时，使每ml血液含15U~20U肝素即可。计算采集的血液量，按1000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血时，边采血边轻轻摇动，使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。
（2）EDTA抗凝：采血前，用灭菌生理盐水将EDTA配制成4％溶液，然后按预采血液的量，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内。采血，并不断摇动采血容器，使之混匀。
（3）玻璃珠法：预先将适量的玻璃珠（根据采血量多少而定）清洗后，装入采血容器中，灭菌后备用。采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。
（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红细胞的保存。一般在4℃条件下，阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。

三、红细胞的分离技术

（一）材料与试剂
1．肝素等抗凝剂
2．3％明胶液取明胶3g，溶于0.9％灭菌盐水100ml中，114.3℃灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存。临用时，37℃预热10min。
3．阿氏液
（二）操作方法
1．采血抗凝，即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊，一般白细胞混杂在其中，忽略不计。
2．根据红细胞的用途，可做进一步的处理。如计算红细胞，可直接稀释计数。如需做补体结合反应，或其它溶红细胞反应，则需将红细胞进行充分的清洗，以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗，2000r/min离心10min，重复3~4次。
3．如需储藏备用，则以阿氏液做抗凝剂采血，混匀后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。

四、淋巴细胞的分离技术

（一）材料与试剂
1．淋巴细胞分层液有两种：
（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrosesolution）,商品名Ficoll，分子量400000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Megluminidiatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.3