透明质酸的发酵生产工艺.doc

食品与制药工程学院课程论文
透明质酸的发酵生产工艺
专业：生物制药姓名：邓海艳课程名称：发酵工程
摘要：透明质酸广泛分布于各种动物组织中，由于动物组织原料有限，且透明质酸的含量低，同时提取成本高，因而价格十分昂贵。而微生物发酵法，所需的原料易得，大大降低了生产成本。同时由于透明质酸存在于菌体英膜上，易于与菌体分离，因而减少了提取成本。本篇文章就是以一株兽疫链球菌作为生产菌株进行研究重点讨论了温度、pH值、搅拌转速，发酵时间以及培养方式等发酵条件对透明质酸产量和分子质量的影响。
关键词：透明质酸；产量；影响因素；发酵条件
透明质酸（hyaluronicacid，简称HA）又名玻璃酸，是一种高分子量的酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中。HA分子中的羧基和极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，可以吸收与保持自身体重千倍以上的水分，是国际上公认的最好的保湿剂，还具有润滑，促进关节愈合等作用[1]。不同分子质量的HA有不同的用途，低分子质量的HA通常用作食品原料，中等分子质量的HA主要应用于化妆品，而高分子量的HA在医学上有较高的应用价值。
1.透明质酸的微生物发酵法
从上个世纪30年代开始，人们便开始进行微生物发酵法生产HA的研究。微生物发酵法生产HA较动物组织提取法有许多的优点，比如生产成本低廉，规模不受原料限制，因为发酵液HA以游离状态存在所以易于HA的分离纯化。能够产生HA的链球菌有A群和C群两类，其中A群主要有化脓链球菌,一般不用作生产菌种，因为其致病性较高；C群有兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌等均属于非人体致病菌，所以可以用作HA的生产菌种罗瑞明等从患肺炎的羊肺液中分离出兽疫链球菌菌株，通过培养基优化得到的HA产量为1.88g/L。冯建成等以StreptococcusequiSHO为出发菌株，通过物理和化学诱变选育到1株遗传稳定、无溶血性且透明质酸酶缺陷型菌株SH0201，通过摇瓶发酵试验得到相对分子量2.06xl06Da的HA。李自刚等从奶牛鼻黏膜内分离到1株兽疫链球菌，经过紫外线诱变和亚硝基胍诱变处理后HA产量能达到6.94g/L[2]。通过微生物发酵法生产HA的品质和产量主要受到以下几个方面的影响:首先是菌种选择；其次是培养基的优化和发酵条件的优化；最后是生物工艺的下游技术即HA的提取工艺。国内外诸多学者研究了微生物发酵法生产HA的工艺。国内，凌沛学等首先开始对HA的发酵生产的工艺进行研究，分别进行了实验室小试和生产车间中试的研究；陈永浩等利用γ射线和紫外线结合方法和通过辐照进行诱变育种，得到了没有溶血性的菌株，使得HA产量及相对分子质量得到了进一步的提高；杨利等对透明质酸分子量的影响因素进行了探索，得到溶氧水平和搅拌转速与HA分子量的关系；付莉等从自然界蹄选到一株透明质酸的产生菌；叶华等对于透明质酸发酵流加过程进行了研究；史鹏等，对发酵法生产透明质酸提取工艺方法进行了研究；郝宁等对HA的生产菌进行了基因改造，基因重组菌的HA产量得到很大程度的提高。HA的发酵生产主要工艺流程如下:
斜面种子一摇瓶种子一接种一发酵培养一补料一放罐一发酵液（加乙醇粗提）一粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）—过滤（去除杂质）一滤液（乙醇沉淀）一沉淀物（脱水干燥）一成品透明质酸
2.发酵培养基成分和发酵条件对HA的影响
2.1不同碳源对发酵的影响
当碳源为2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨1.0%，KH2PO40.2%，NaCl0.2%，MgSO4·7H2O0.03%，pH7.2，装量为10%；37℃，100rpm培养18h。
以葡萄糖为碳源时，透明质酸的产量最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖和果糖。而木糖和半乳糖利用情况不好，以它们为碳源时透明质酸产量只有0.4g/L和0.42g/L。其原因可能是UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄合成透明质酸的前体物质，也是合成菌体的前体物质，菌体可以容易地分解蔗糖和麦芽糖得到葡萄糖，果糖也很容易转化为葡萄糖，所以它们能被比较好的利用，而其他两种碳源的利用情况则相对差些。因此本实验采用葡萄糖为碳源。
2.2不同氮源对发酵的影响
当氮源为2.0%，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl0.2%，MgSO4·7H2O0.03%，pH7.2，装量为10%，37℃，100rpm培养18h。
氮源不仅为菌体生长提供氮元素，而且大多数有机氮源还能提供多种必需的生长因子。当发酵培养基的氮源采用酵母膏时，透明质酸的产量最高。其次是酵母膏和蛋白胨的混合氮源，其余的均较底。而采用无机氮源（NH4）2SO4时，透明质酸含量和菌体量都是最低的。兽疫链球菌的营养要求比较高，TCA循环不完全，有多种氨基酸不能自身合成，而且不能完全由自身合成核昔酸。而酵母膏中含有大量的菌体生长所需的生长因子，这可能是兽疫链球