绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达.doc

绿色荧光蛋白(GFP）基因的克隆和表达
背景知识
绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27.0kMr,其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内.发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser—Tyr-Gly自身环化和氧化形成.
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验一质粒DNA的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒DNA提取方法:碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高,可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。
二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位.迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb.质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的.有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制,因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质粒,有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒,它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时(例如经氯霉素处理)，细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记,当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时,转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型,例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化.
细菌的生长和质粒的扩增
从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落,接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒(如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如pBR322）来说,则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离
质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：(1)大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多.（2)从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS(十二烷基硫酸钠)和NaOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH）,质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来,而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。
3、质粒DNA的提纯
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的.
质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA(cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管