凝胶过滤层析分子筛层析排阻层析.pptx

实验七凝胶过滤层析纯化细胞色素C一、目的要求二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。内水体积Vi
外水体积Vo
柱床体积Vt
洗脱体积Ve
Vt=Vo+Vi+Vg
Ve=Vo+KdVi
Kd=(Ve-Vo)/Vi
Kd=0
Kd=1
0<Kd<1
Kd>1
优点：
a.条件温和b.操作简便c.损失少回收率高d.层析柱可反复使用
凝胶的类型：
Sephadex:交联葡聚糖

Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelA
Bio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛
Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶
凝胶及柱的选择

装柱的两种方法：
a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
（如图4-9）
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2%
制备用量：柱床体积的20—30%
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
应用
a.分离蛋白质
b.脱盐
c.蛋白质分子量的测定三、试剂与器材
试剂：0.01mol/lTris-HCl缓冲液，PH7.5，含0.2mol/lNaCl
器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪、记录仪四、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0”，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。
6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。
7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。
记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。
数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A部分收集器的操作方法2．定位，
将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或“顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在“顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。
五、操作方法（二）装柱
1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。
2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。
（三）凝胶柱的平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。（四）加样
1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。
（五）洗脱
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025mol/LTris-HCl，以每管3mL/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。
样品溶液
(六）收集细胞色素C
收集带有红色的洗脱液，即为经凝胶过滤柱层析纯化的细胞色素C。
六、注意事项
1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
2）装柱要均