一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113817874A(43)申请公布日2021.12.21(21)申请号202111244618.9(22)申请日2021.10.26(71)申请人苏州药明检测检验有限责任公司地址215104江苏省苏州市吴中经济开发区吴中大道北侧(72)发明人秦冲李欣喜陈源源汪景长童涌(74)专利代理机构上海浦一知识产权代理有限公司31211代理人戴广志(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/02(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图3页(54)发明名称一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法(57)摘要本发明公开一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法，以LLC‑MK2细胞作为检测呼肠孤病毒3型的指示细胞，利用结晶紫染色并读取病毒空斑数目，根据空斑数目结合对应的稀释倍数计算呼肠孤病毒3型的滴度。本发明中的LLC‑MK2指示细胞与呼肠孤病毒3型有高度敏感性，能产生易于观察的病毒空斑，且病毒滴度与产生的空斑数目呈良好线性关系，稳定性、重现性好，灵敏度高，适用于病毒的清除/灭活验证研究。CN113817874ACN113817874A权利要求书1/1页1.一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)用不同稀释倍数的呼肠孤病毒3型病毒液感染LLC‑MK2，获得接种细胞；2)在细胞培养箱中孵育接种细胞；3)孵育后弃去呼肠孤病毒3型病毒液，将接种细胞置于细胞培养箱中培养；4)对培养后的接种细胞进行染色，显现出空斑，读取空斑数目；5)根据空斑数目以及对应的稀释倍数计算呼肠孤病毒3型滴度。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述LLC‑MK2接种于含细胞培养基的细胞培养六孔板中。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养六孔板中每个培养孔接种2.0×105～3.0×105个LLC‑MK2。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，对呼肠孤病毒3型病毒液作10倍～108倍系列稀释。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养六孔板中每个培养孔中加入相同体积的呼肠孤病毒3型病毒液。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养六孔板中每个稀释度的呼肠孤病毒3型病毒液做3个复孔。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，将接种细胞立即转移入细胞培养箱中，进行孵育。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，在孵育后的接种细胞中加入细胞培养基‑琼脂混合物，在室温下放置10至30分钟，直至细胞培养基‑琼脂混合物完全凝固后将接种细胞置于细胞培养箱中培养8天。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，接种细胞染色前，加入适量甲醛，使甲醛充分覆盖细胞，并将细胞固定至少一小时。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，固定完成后，去除接种细胞表面的细胞培养基‑琼脂混合物，用结晶紫染色液对接种细胞染色5分钟，然后洗净、晾干。11.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述呼肠孤病毒3型病毒液的稀释液为HEPES缓冲液。12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基为DMEM完全培养基。13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基‑琼脂混合物包括2×细胞培养基和1％低熔点琼脂糖。2CN113817874A说明书1/5页一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法。背景技术[0002]近年来，重组蛋白、抗体等生物制品已成为生物医药产业中最重要的产品。现代生物制品常以动物细胞作为蛋白表达系统，以保证蛋白产品的生物活性。但细胞体系极易受到病毒的污染，因此各国药监机构要求这类制品在临床实验前和生产阶段前申报材料中纯化工艺必须经过病毒清除/灭活验证，以确保不会出现病毒污染，保证患者的用药安全。[0003]呼肠孤病毒3型(mammalianorthoreovirustype‑3,Reo‑3)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)中的哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalianorthoreovirus)，是一种非包膜RNA病毒。病毒颗粒呈圆球形，直径约为85nm。呼肠孤病毒3型对脂类溶剂具有抵抗力，并在较宽的pH范围内稳定，蛋白水解酶可能会通过切割病毒衣壳蛋白而增加呼肠孤病毒3型的感染能力。苯酚，福尔马林，95％乙醇和β‑丙内酯均可灭活病毒。因呼肠孤病毒3型表现出较为广泛的理化耐受性特点，因此常被作为非特异性“模型”病毒进行病毒清除研究，用来评价生产工艺灭活/去除病