一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113897343A(43)申请公布日2022.01.07(21)申请号202111062610.0C12N9/88(2006.01)(22)申请日2021.09.10C12N1/14(2006.01)C12R1/685(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNO.230602021.08.23(71)申请人常州大学地址213164江苏省常州市武进区滆湖路1号(72)发明人蔡志强徐珂盼赵希岳郭静洪婷婷朱孝霖杨广花(74)专利代理机构常州市英诺创信专利代理事务所(普通合伙)32258代理人王志慧(51)Int.Cl.C12N9/18(2006.01)C12N9/24(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图6页(54)发明名称一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法(57)摘要本发明属于生物发酵工程领域，具体公开了一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法。本发明通过从不同土壤中筛选出产果胶酶性能较好的菌株黑曲霉，再设置培养基组分固体基质、金属离子及其浓度、含水量，培养温度、pH、装料量，建立单因素试验和正交试验从而得到菌株产酶最高的培养基组分和培养条件。本发明提供的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，大大提高了菌株产酶能力，达到理想目标。CN113897343ACN113897343A权利要求书1/2页1.一种黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：所述方法为：从草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田土壤中依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，并通过分子生物学鉴定，确认所筛选菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)；然后将黑曲霉接种于PDA液体种子培养基中，在恒温摇床中28℃培养2d，得到黑曲霉菌球，取菌球于固态发酵培养基中发酵培养，得到果胶酶。2.根据权利要求1所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：(1)菌株筛选依据刚果红方法筛选出有透明圈的菌株，并通过分子生物学鉴定，确认所筛选菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)；(2)菌种活化将黑曲霉划线至PDA琼脂培养基上，在恒温培养箱28℃培养3d，得到长满黑曲霉孢子的平板；(3)菌球制备将平板上的孢子于无菌超净工作台挑取一环接种至PDA液体培养基中，在恒温摇床中28℃培养2d，得到黑曲霉菌球；(4)固态发酵取黑曲霉菌球于固态发酵培养基中发酵培养。3.根据权利要求2所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤(1)所述菌株筛选具体步骤如下：1)分别称取取自草莓园、桃园、葡萄园、紫叶李、杨梅树、油菜花田及小麦田土壤放于蒸馏水中，置于28℃，160r/min恒温摇床20min，再取出静置10min，采用稀释涂布法涂布于果胶培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培养，待菌株长出后，用平板划线法分离纯化菌株；采用单点法将纯种菌株接种在果胶培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用氯化钠溶液进行洗脱，观察菌株是否产生透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(DC)和透明圈直径(DP)，计算DP/DC的比值，选择产生透明圈的菌株用来进行复筛；2)将初筛的菌株接种到果胶液体培养基中进行发酵培养，测定各个菌株的果胶酶酶活力，选取果胶酶酶活力最高的菌株作为实验出发菌株，并鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)。4.根据权利要求3所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤1)所述果胶培养基的成分为：果胶8g/L，NH4Cl0.4g/L，MgSO4·7H2O2g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L、琼脂20g/L。5.根据权利要求3所述的黑曲霉固态固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤2)所述果胶液体培养基成分为：果胶8g/L，NH4Cl0.4g/L，MgSO4·7H2O2g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L。6.根据权利要求3所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤2)所述筛选出的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株CM3保藏号为：CGMCCNo，23060，保藏日为2021年8月23日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。7.根据权利要求2所述的黑曲霉固态发酵产果胶酶的方法，其特征在于：步骤(4)所述2CN113897343A权利要求书2/2页固态发酵培养基成分如下：以麸皮、豆粕、菜籽饼粉、棉籽饼粉、黄豆粉或麸皮与豆粕混合作为固体基质，其中，麸皮与豆粕混合的比例为93：2‑13：82，以K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+为金属离子，金属离子浓度为0.4％‑1.6％，含水量为培养基总质量的45％‑65％。8.根据权利要求2所述的黑曲霉固态发酵产