基因组连续整合系统、应用及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114277050A(43)申请公布日2022.04.05(21)申请号202111634553.9(22)申请日2021.12.29(71)申请人天津科技大学地址300457天津市滨海新区经济技术开发区第十三大街9号(72)发明人谢周杰刘浩许璐(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209代理人韩晓梅(51)Int.Cl.C12N15/76(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N15/52(2006.01)C12R1/465(2006.01)权利要求书1页说明书14页序列表6页附图6页(54)发明名称基因组连续整合系统、应用及方法(57)摘要本发明公开了一种基因组连续整合系统，所述系统为重组工程菌株，该重组工程菌株是利用重组选择性标记基因，且重组选择性标记内部含有位点特异性重组酶识别位点，来实现外源基因/簇的连续整合入宿主基因组，来构建得到的。本发明系统不受选择性标记数目的限制，可以连续多次使用，方便构建包含任意拷贝数的目标基因(簇)的工程菌株。采用本发明系统构建的工程菌株只包含有一个功能性抗性基因，方便后续的其它定向遗传改造。CN114277050ACN114277050A权利要求书1/1页1.一种基因组连续整合系统，其特征在于：所述系统为重组工程菌株，该重组工程菌株是利用重组选择性标记基因，且重组选择性标记内部含有位点特异性重组酶识别位点，来实现外源基因/簇的连续整合入宿主基因组，来构建得到的。2.一种基因组连续整合系统，其特征在于：所述系统包含两个质粒载体pINT01和pINT02。3.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT01包含有重组安普霉素抗性基因aprB10和attP整合位点；aprB10是在安普霉素抗性基因acc(3)IV第62、82、166、218个密码子后同框插入了attB10反向序列所获得，基因aprB10的序列为SEQIDNO.1。4.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT01的构建步骤如下：将序列为SEQIDNO.1的基因aprB10替代质粒pIJ10500中的潮霉素抗性基因aph，获得重组质粒pINT01。5.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT02包含有重组潮霉素抗性基因hygB和attP10整合位点；hygB是在潮霉素抗性基因aph第123、135、168、215个密码子后插入attB反向互补序列获得的重组基因，能够作为潮霉素抗性标记基因使用，基因hygB的序列为SEQIDNO.2。6.根据权利要求2所述的基因组连续整合系统，其特征在于：所述载体pINT02构建步骤如下：将质粒pIJ10500中引入attP10序列，消除attP位点和ΦBT1整合酶编码基因，并将潮霉素抗性基因aph替换为序列为SEQIDNO.2的重组潮霉素抗性基因hygB，最终获得重组质粒pINT02。7.如权利要求2至6任一项所述的基因组连续整合系统在构建包含任意拷贝数的目标基因/簇的工程菌株方面中的应用。8.如权利要求2至6任一项所述的基因组连续整合系统在将外源基因连续导入宿主基因组方面中的应用。9.利用如权利要求2至6任一项所述的系统的高效基因组连续整合方法，其特征在于：步骤如下：通过交替使用两个质粒载体pINT01和pINT02，将不同外源基因/簇连续导入目标菌株，或将同一基因/簇连续导入宿主菌，实现基因簇的多拷贝化。2CN114277050A说明书1/14页基因组连续整合系统、应用及方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其是一种基因组连续整合系统、应用及方法。背景技术[0002]代谢工程与合成生物学研究中经常需要在宿主基因组上引入多酶途径或者引入编码途径的多个拷贝，以实现相关基因的稳定表达和高效表达。比如在模式生物酵母菌中，通过Di‑CRISPR(deltaintegrationCRISPR‑Cas)方法可以一步实现目标基因的多拷贝、无标记整合(MetabolicEngineering33(2016):19‑27)。该方法的成功依赖于宿主具有的高效同源重组系统。而对于链霉菌等其它工业菌株，同源重组效率低，采用类似的策略实现目标基因(簇)在基因组上的整合和多拷贝化十分具有挑战性。LiLei等人通过引入噬菌体来源的位点特异性重组系统，可以在链霉菌中实现目标基因(簇)的多拷贝整合或者连续整合(MetabolicEngineering52(2019)153–167)，但是通过该方法构建重组工程菌时，由于选择标记基因数量和整合酶种类的限制，最多可以进行5次整合(实现5个拷贝)，并且