基因工程的酶学基础.pptx

第二章基因工程的酶学基础本章节内容本章学习内容一、限制性核酸内切酶2.性质细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（3）限制与修饰系统相关的三个基因1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。
如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶Ⅰ型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。EcoRI5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’

PstI5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’

产生粘性末端含有几个核苷酸单链的末端。CTGCAGi）不同的DNA双链：B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。[3]平齐末端（bluntend）[4]平齐末端的特点ⅱ）削除(平)法
利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。XmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GATC----3’
3’----CTAG-5’限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。②诱发星号（*）活性的原因在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能（4）II型限制性内切酶对单链DNA的切割3.Ⅲ类限制性内切酶核酸限制性内切酶的类型及主要特性四、限制性内切酶酶解反应条件2.酶解过程①酶解体系大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：②混匀③反应终止④酶解结果鉴定酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带3.限制性内切酶对DNA分子的消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开只有有限数量的酶切位点被切开（4）几种常用限制酶识别位点4.限制性内切酶酶解反应中的注意事项④酶分装成小份，避免反复冻融DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。
DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ugDNA。大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。每微克DNA用1～5单位的酶，保温1~2小时。
是影响限制酶活性的重要因素（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品练习题从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。DNA连接酶:（1）大肠杆菌连接酶（1）必须是两条双链DNA（4）DNA连接酶的反应条件1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。5.3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端？连接酶反应的最佳温度是37C。增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。3.反应温度六、DNA连接的反应体系从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）第三节DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶1.共同特点DNA聚合酶三、DNA聚合酶在基因工程中的用途标记标记③DNA聚合酶I对探针序列的标记5’3’外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。纯化的DNA片断2.Klenowfragment①3’端补平3’隐蔽末端的DNA片断③cDNA第二链的合成（1）T4DNA聚合酶的性质③特点（2）T4DNA聚合酶的用途酶切中间产生两个末端标记a.放射性标记的优缺点：b.非放射性标记纯化的DNA片断ii）地高辛标记：4.T7DNA聚合酶（2）T