一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103555738103555738A(43)申请公布日2014.02.05(21)申请号201310513641.2(22)申请日2013.10.25(71)申请人山东省花生研究所地址266000山东省青岛市李沧区浮山路126号(72)发明人陈娜禹山林杨庆利迟晓元潘丽娟陈明娜王通王冕杨珍(51)Int.Cl.C12N15/53(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12Q1/26(2006.01)权利要求书2页权利要求书2页说明书7页说明书7页序列表3页序列表3页附图2页附图2页(54)发明名称一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法(57)摘要本发明公开了一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法，通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR进行克隆合成出了逆境胁迫AhROLP1基因，该基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸；基因氨基酸序列与与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。通过荧光定量PCR验证了AhROLP1在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高，并且此后一直维持在较高的水平。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。CN103555738ACN103578ACN103555738A权利要求书1/2页1.一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育33，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22-28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；材料的低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mMNaCl或重量浓度20%PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；（2）RNA的提取和cDNA的合成按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasyMiniKit分离提取花生幼苗RNA，RQ1RNase-freeDNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成，用M-MLVReverseTranscriptase进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μgRNA，在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；（3）基因克隆通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LATaqTMDNApolymerase，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl2的2.5μL10×PCRbuffer；2.5μL10mMdNTPs；1μLcDNA模板；0.5μLLApolymerase和17.5μLddH2O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min；扩增基因全长所用引物为AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’；PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-TEasyvector并测序。2.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸。3.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。4.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的核苷酸序列是序列表中序列1。5.根据权利要求1所述的一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法，其特征在于，所述的AhROLP1基因的氨基酸序列是