用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103571795103571795A(43)申请公布日2014.02.12(21)申请号201310538492.5C12Q1/02(2006.01)(22)申请日2013.11.04C12R1/93(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO：C20131332013.09.04(71)申请人中国科学院武汉病毒研究所地址430071湖北省武汉市武昌区水果湖街小洪山中区44号(72)发明人邓菲邓马平张艳芳王华林胡志红(74)专利代理机构北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)11371代理人吴开磊(51)Int.Cl.C12N5/10(2006.01)C12N15/85(2006.01)权利要求书2页权利要求书2页说明书5页说明书5页C12Q1/70(2006.01)序列表2页序列表2页附图2页附图2页(54)发明名称用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法(57)摘要本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法。其中，用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法为：构建报告质粒；利用报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。本发明提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法，用于杆状病毒滴度测定时更为快速，测定结果更为准确。CN103571795ACN103579ACN103571795A权利要求书1/2页1.用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其特征在于，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNo.C2013133；其保藏命名为：携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9-p。2.权利要求1所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建报告质粒；所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。3.根据权利要求2所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，在所述利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞的步骤中，所述转染的时间为46-50小时。4.根据权利要求2所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，在所述将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆的步骤中，所述培养基为：含有200ng/ml-800ng/ml的博来霉素以及体积分数为10%的胎牛血清的Grace培养基。5.根据权利要求1所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其特征在于，在所述将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系的步骤中，所述博来霉素的浓度为200ng/ml-800ng/ml。6.一种根据权利要求1所述的重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组细胞系制成细胞悬液；在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述将重组细胞系制成细胞悬液的步骤中，具体包括：用Grace培养液将所述重组细胞系稀释，得到浓度为2×104个/ml到5×104个/ml的所述细胞悬液。8.权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述将重组细胞系制成细胞悬液的步骤中，所述细胞悬液中加入有卡那霉素和/或链霉素。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度的步骤中，具体包括：在所述待测的杆状病毒液中加入等量的细胞悬液，在27℃至28℃培养3-5天之后观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒液包括：2CN103571795A权利要求书2/2页苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒液。3CN103571795A说明书1/5页用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法。背景技术[0002]杆状病毒是一类DNA病毒，广泛存在于自然界，主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫，其感染能够导致昆虫的液化死亡。随着研究的深入，杆状病毒已在生物杀虫剂、真核表达、