检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105353054A(43)申请公布日2016.02.24(21)申请号201510978126.0(22)申请日2015.12.22(71)申请人内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司地址011500内蒙古自治区呼和浩特市和林格尔盛乐经济园区(72)发明人李照张雪峰崔向云徐向峰袁凤琴常建军宋晓东(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201代理人李志东(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)权利要求书2页说明书10页(54)发明名称检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的方法(57)摘要本发明提出检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的预处理方法及检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的方法。所述预处理方法包括：(1)将所述发酵乳与提取液进行混合；(2)将步骤(1)所得到的混合物进行离心处理，并收集上清液；(3)将所述上清液进行浓缩处理，并利用缓冲液将所述浓缩处理的产物进行定容，以便得到待净化溶液；(4)利用免疫亲和柱对所述待净化溶液进行净化处理，得到洗脱液；以及(5)将所述洗脱液进行浓缩处理，并用乙腈水溶液进行定容，以便得到待测液。本发明的方法具有下列优点的至少之一：操作简便、快速、回收率高和灵敏度高。CN105353054ACN105353054A权利要求书1/2页1.一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的方法，其特征在于，包括：(1)称取调制乳样品10g于50mL离心管中，加入25毫升提取液(乙腈和甲醇按体积比8:2)，得到混合液，将所述混合液高速振荡2min，并将得到的液体在5000转/分钟下离心5分钟，收集上清液；(2)将所述上清液在45-48摄氏度下旋转蒸发到体积5升，再用磷酸二氢钠缓冲液(pH值为7.4～8.5)定容到50毫升并混匀，得到待净化溶液，然后将所述待净化溶液以2mL/min～3mL/min的流速通过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃流出液，然后用10毫升水以2mL/min～3mL/min的速度淋洗黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃流出液，再用6毫升乙腈以2mL/min～3mL/min的速度洗脱黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，得到洗脱液；(3)将所述洗脱液在氮吹仪下吹干，用乙腈-水溶液(乙腈和水的体积比1:9)定容到1mL，涡旋混匀，过0.22μm的有机滤膜，用液相色谱-质谱测定，其中(3-1)质谱条件：电离方式为电喷雾电离，正离子；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；锥孔反吹气流量为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流量为500L/h；电子倍增电压为650V；扫描方式为多离子反应监测；针对黄曲霉毒素M1，离子选择参数包括：母离子312.9，子离子240.7和284.6，碰撞能量是38和22，驻留时间是0.05min；针对黄曲霉毒素B1，离子选择参数包括：母离子329.1，子离子259和273，碰撞能量是25和25，驻留时间是0.1min；(3-2)液相色谱条件：流动相流动速度：0.3mL/min；色谱柱柱温：40℃；试液温度：20℃；进样体积：10μL；流动相：A相，0.1％甲酸溶液；B相，乙腈溶液。2.一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的预处理方法，其特征在于，包括：(1)将所述发酵乳与提取液进行混合，其中，所述提取液包括乙腈和甲醇，所述乙腈体积不小于甲醇体积；(2)将步骤(1)所得到的混合物进行离心处理，并收集上清液；(3)将所述上清液进行浓缩处理，并利用缓冲液将所述浓缩处理的产物进行定容，以便得到待净化溶液；(4)利用免疫亲和柱对所述待净化溶液进行净化处理，得到洗脱液；以及(5)将所述洗脱液进行浓缩处理，并用乙腈-水溶液进行定容，以便得到待测液。2CN105353054A权利要求书2/2页3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乙腈和甲醇的体积比为8:2，基于1克所述发酵乳，所述提取液的添加量为2～3毫升。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为7.4～8.5。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述净化处理包括：将所述待净化溶液通过免疫亲和柱，弃流出液，然后用水淋洗免疫亲和柱，弃流出液，再用乙腈洗脱免疫亲和柱，得到洗脱液。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比为1:9。7.一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的方法，其特征在于，包括：(1)利用权利要求2～6任一项所述的预处理方法对所述发酵乳进行预处理；以及(2)采用液相色谱-质谱联用法对步骤(1)所得到的混合物进行检测，并基于检测结果确定所述发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1的含量。8.根据权利要