西红花及西红花内生真菌GGPPS基因、基因克隆方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106282208A(43)申请公布日2017.01.04(21)申请号201610859892.XC12N15/10(2006.01)(22)申请日2016.09.28C12P23/00(2006.01)C12P27/00(2006.01)(83)生物保藏信息C12P17/06(2006.01)CGMCCNO.116062015.11.24C12R1/645(2006.01)(71)申请人上海师范大学地址200234上海市徐汇区桂林路100号(72)发明人赵军曾子金焉兆萍(74)专利代理机构上海科盛知识产权代理有限公司31225代理人褚明伟(51)Int.Cl.C12N15/54(2006.01)C12N9/10(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N1/14(2006.01)权利要求书2页说明书13页附图2页(54)发明名称西红花及西红花内生真菌GGPPS基因、基因克隆方法与应用(57)摘要本发明涉及西红花及西红花内生真菌GGPPS基因、基因克隆方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明公开了西红花和西红花内生真菌的代谢途径中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranylpyrophosphatesynthase，GGPPS)两个基因，其具有SEQIDNO.4和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；两个基因具有相同的SEQIDNO.1序列所示开放阅读框，编码SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。通过颜色遗传互补反应验证了该GGPPS基因编码的蛋白是具有典型GGPPS酶功能，可催化FPP和IPP合成GGPP(C20)。CN106282208ACN106282208A权利要求书1/2页1.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其特征在于，其是如下的基因(a)或基因(b)：基因(a)：具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的基因；基因(b)：由SEQIDNo.3所示的核苷酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成功能的基因。2.根据权利要求1所述的一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其特征在于，该基因的cDNA全长序列具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。3.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因启动子，其特征在于，所述启动子选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、具有SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；b、与SEQIDNo.5互补的核苷酸序列。4.一种西红花内生真菌，其特征在于，生物学名称为Cadophoraluteo-olivacea.，其指定名称为3P1CQ1，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.11606，保藏日期为：2015年11月24日。5.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于，其是如下的蛋白质(a)或蛋白质(b)：蛋白质(a)：具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质；蛋白质(b)：由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成功能的蛋白质。6.一种西红花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因，其特征在于，其cDNA开放阅读框序列具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。7.一种西红花内生真菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：1)根据CTAB法提取西红花内生真菌菌丝体基因组DNA，然后在NCBIGenBank中搜索同源属中已报道的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因序列，根据同源性设计引物Fg1：5'-AAATCAGTTCTGCGACCTGTTCC-3'和Rg1：5'-CGGTCTTGTTTCCAACCATTTC-3'，经PCR扩增得到584bp的GGPPS基因保守片段；2)根据该584bp基因序列设计3′端和5′端RACE特异引物GSP1：5'–ATCGCCTTGGGGTTCTTCAGC–3'、GSP2：5'–CGACCTGTTCCAGAGGGCGATTG–3'、GSP3：5'–GCCAGTCTGAATAACCCTCCTGTCTT–3'；3)运用RACE技术的同源性克隆方法，克隆出GGPPS基因3′端和5′端cDNA基因序列，经序列拼接得到cDNA的全长序列，如SEQIDNo.1所示；4)设计ORF酶切引物fGGPPS：5'-GAAGATCTATGTTCCACAGCAACCGCTCAGCAC-3'和rGGPPS：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAACAGCCATCTTATCC-3'，克隆牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的cDNA和DNA序