一种牛奶中微生物DNA的提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106381294A(43)申请公布日2017.02.08(21)申请号201510474702.8(22)申请日2015.08.06(71)申请人中创云牧科技咨询(北京)股份有限公司地址100048北京市海淀区紫竹院路116号C座3层3579号(72)发明人郝永清(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书3页(54)发明名称一种牛奶中微生物DNA的提取方法(57)摘要本发明公开了一种牛奶中微生物DNA的提取方法，包括：取乳样0.8mL加入到0.3～0.5mLES溶液(0.5mol/LEDTA(pH7.5)、0.2％SDS)中，混匀，离心，弃上清；加入0.8～1.2mLPBS缓冲液，振荡摇匀，离心，弃上清；加入20～30μL质量浓度为0.02mg/mL的溶葡萄球菌酶；加入150～200μL质量百分浓度为10％的Chelex-100水溶液，剧烈振荡5～10s，置于100℃沸水中加热8～12min；离心，最后取上清液用于PCR反应即可。本发明采用Chelex-100法可经济、快速、有效地从乳样中直接提取细菌DNA，用于PCR检测奶牛乳房炎主要致病菌。CN106381294ACN106381294A权利要求书1/1页1.一种牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取乳样0.8mL加入到0.3～0.5mLES溶液中，混匀，然后在10000～15000r/min的转速下离心8～12min，弃上清；所述ES溶液含有0.5mol/L的EDTA和0.2wt％的SDS，所述EDTA的pH值为7.5；(2)加入0.8～1.2mLPBS缓冲液，振荡摇匀，然后在8000～12000r/min的转速下离心3～8min，弃上清；(3)加入20～30μL质量浓度为0.02mg/mL的溶葡萄球菌酶；加入150～200μL质量百分浓度为10％的Chelex-100水溶液，剧烈振荡5～10s，置于100℃沸水中加热8～12min；接着在10000～15000r/min的转速下离心3～8min，最后取上清液用于PCR反应即可。2.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，ES溶液的用量为0.4mL。3.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，转速为12000r/min，离心时间为10min。4.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PBS缓冲液的用量为1mL。5.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，转速为10000r/min，离心时间为5min。6.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，溶葡萄球菌酶的用量为25μL，Chelex-100水溶液的用量为175μL。7.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，沸水中加热10min。8.根据权利要求1所述的牛奶中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转速为12000r/min，离心时间为5min。2CN106381294A说明书1/3页一种牛奶中微生物DNA的提取方法技术领域[0001]本发明涉及奶牛分子生物学技术领域，具体是一种牛奶中微生物DNA的提取方法。背景技术[0002]奶牛乳房炎是影响中国乃至世界乳业发展的最重要的疾病之一，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体和大肠杆菌等致病菌的感染是引起该病的最主要原因。目前，国内尚缺乏有效的疫苗用来预防奶牛乳房炎。防治该病的关键因素在于鉴定其致病菌，一旦确定致病菌，则可立即采取相应的措施。[0003]对于奶牛乳房炎致病菌的PCR检测中，乳样中细菌DNA模板的制备是影响检测速度、敏感性的主要因素之一。为缩短检测时间，目前国内直接提取牛奶中致病菌DNA的方法有：①苯酚-氯仿法，其操作步骤较为复杂、耗时长，损失DNA的同时，也容易造成各乳样之间的污染；残留在DNA中的酚等有机物对DNA聚合酶有一定抑制作用。此外，该法需要腐蚀性、有毒的有机溶剂，如苯酚等，对人员、环境都有不良影响。②核酸纯化柱法，由于其复杂性和较高的成本，使得难以运用到大批量乳样的检测中。③磁珠法，此法提取乳样细菌DNA所需的成本较高，限制了其在大量乳样检测中的应用。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种牛奶中微生物DNA的提取方法，采用Chelex-100法可经济、快速、有效地从乳样中直接提取细菌DNA，用于PCR检测奶牛乳房炎主要致病菌。[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0006]一种牛奶中微生