一种氟嘧菌酯半抗原的制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106543163A(43)申请公布日2017.03.29(21)申请号201610980256.2(22)申请日2016.11.08(71)申请人佛山市飞时达新材料科技有限公司地址528531广东省佛山市高明区荷城街道江湾路78号403室(72)发明人叶青(74)专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司11246代理人连围(51)Int.Cl.C07D413/12(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K16/44(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称一种氟嘧菌酯半抗原的制备方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种氟嘧菌酯半抗原的制备方法及其应用，该制备方法以氟嘧菌酯工艺合成路线中的关键中间体3-[1-(2-羟基苯基)-1-(甲氧亚氨基)-甲基]-5,6-二氢-1,4,2-二噁嗪为原料，先与4,5,6-三氟嘧啶发生醚化反应，再与邻羟基苯乙酸甲酯反应得到氟嘧菌酯半抗原，合成的方法简单，产物纯度和产率高；采用碳二亚胺法将半抗原直接与牛血清蛋白偶联后免疫小鼠，产生针对氟嘧菌酯的特异性抗体；制备的检测氟嘧菌酯的试剂盒可用于直接竞争酶联免疫分析中，满足国内对氟嘧菌酯残留的检测需要。本发明提供的氟嘧菌酯半抗原为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的氟嘧菌酯的检测方法提供了新的物质基础。CN106543163ACN106543163A权利要求书1/2页1.一种氟嘧菌酯半抗原的制备方法，其特征在于：以3-[1-(2-羟基苯基)-1-(甲氧亚氨基)-甲基]-5,6-二氢-1,4,2-二噁嗪为原料，先与4,5,6-三氟嘧啶发生醚化反应，再与邻羟基苯乙酸甲酯反应得到氟嘧菌酯半抗原；所述氟嘧菌酯半抗原的制备方法包括以下步骤:(1)在0℃下，将等摩尔比的3-[1-(2-羟基苯基)-1-(甲氧亚氨基)-甲基]-5,6-二氢-1,4,2-二噁嗪和4,5,6-三氟嘧啶溶于1L四氢呋喃中，再加入7.0g80％的氢化钠植物油悬浮液得到混合液，在0℃下磁力搅拌反应3h，转速为1500-2000r/min，随后不再进行冷却，继续搅拌12-14小时，反应液用乙酸乙酯消化并用水反复洗涤，有机相用硫酸钠干燥并减压浓缩，得到黏稠油状物，待该油状物形成结晶，得到3-{1-[2-(4,5-二氟嘧啶-6-基氧基)-苯基]-1-(甲氧亚氨基)-甲基}-5,6-二氢-1,4,2-二噁嗪；(2)将步骤(1)制备的3-{1-[2-(4,5-二氟嘧啶-6-基氧基)-苯基]-1-(甲氧亚氨基)-甲基}-5,6-二氢-1,4,2-二噁嗪和等摩尔比的邻羟基苯乙酸甲酯溶于1L二甲基甲酰胺中，再加入32g碳酸钾和2.2g氯化亚铜，将该混合液加热到100℃反应12-14小时；(3)将步骤(2)的反应结束后得到的混合液恢复到室温，再加入10-30％浓度的盐酸，加热5-10h，静置并冷却到室温，过滤，滤饼用去离子水漂洗，烘干后得到氟嘧菌酯半抗原。2.一种氟嘧菌酯半抗原在制备氟嘧菌酯人工抗原方面的应用，其特征在于：将所述氟嘧菌酯半抗原与载体蛋白偶联后，利用碳二亚胺法制备氟嘧菌酯人工抗原，包括以下步骤：(1)将氟嘧菌酯半抗原先用DMSO溶解成50mg/mL的储存液，取50-100μL上述储存液，加入1mL浓度为0.1mol/L、pH为7.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸偶联缓冲液稀释，得到氟嘧菌酯半抗原稀释液；(2)称取2.5-5mg载体蛋白溶于0.4mL浓度为0.1mol/L、pH为7.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸偶联缓冲液中，得到载体蛋白溶液；(3)在室温磁力搅拌下，转速为1500-2000r/min，将步骤(1)得到的氟嘧菌酯半抗原稀释液加入步骤(2)得到的载体蛋白溶液中，再加入4mg(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，继续搅拌反应2h，然后将反应液装入透析袋中，4℃下在磷酸缓冲盐溶液中透析72h，每天换三次透析液，得到的产物以5000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液，上清液为氟嘧菌酯人工抗原，保存于-20℃冰箱中。3.根据权利要求2所述的氟嘧菌酯半抗原在制备氟嘧菌酯人工抗原方面的应用，其特征在于：所述的载体蛋白为牛血清蛋白，氟嘧菌酯半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为30-50:1，所述的氟嘧菌酯人工抗原为免疫原。4.根据权利要求2所述的氟嘧菌酯半抗原在制备氟嘧菌酯人工抗原方面的应用，其特征在于：所述的载体蛋白为卵清蛋白，氟嘧菌酯半抗原与卵清蛋白的摩尔比为15-20:1，所述的氟嘧菌酯人工抗原为为包被原。5.一种氟嘧菌酯半抗原在制备氟嘧菌酯多克隆抗体方面的应用，其特征在于：通过将所述的氟嘧菌酯半抗原与牛血