血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制.docx

血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制作者：姜彩肖张丽梅杭景仙【摘要】目的研究血管性痴呆（VD）大鼠学习记忆障碍及发病机制。方法4血管阻断法制作模型，Morris水迷宫法检测学习记忆能力，免疫组化法观察Bcl?2和Bax表达，流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率，亚甲蓝比色法检测血清中H2S含量。结果模型组大鼠学习记忆能力明显减退。Bcl?2/Bax在缺血再灌注（I/R）开始时升高，随后开始下降。模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加。模型组大鼠血清中H2S含量明显减少。血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率间呈明显负相关。结论VD可导致学习记忆障碍，海马神经细胞凋亡和血清中H2S含量减少；海马神经细胞凋亡程度可能与内源性H2S生成减少有关。【关键词】血管性痴呆；学习记忆；免疫组化；流式细胞术；硫化氢血管性痴呆（VD）是老年期痴呆的主要类型之一，它是由一系列脑血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征〔1〕，不仅给病人带来长期痛苦，严重影响其生活质量，而且给家庭、社会造成沉重负担，因此研究VD的发病机制以指导其防治具有很高的社会价值和现实意义。H2S是第三类气体信号分子，广泛参与机体的多种生理和病理过程，为进一步了解其在VD发病中的作用，本研究观察大脑缺血/再灌注（I/R）不同时间对大鼠学习记忆能力的影响、血清中H2S含量改变及海马CA1区神经细胞凋亡情况，从行为学、细胞凋亡及内源性H2S表达量及其相互关系等方面，探讨VD的发病机制，为其防治提供理论依据。1材料与方法1.1动物与分组健康Wistar雄性大鼠64只，体重300——350g（由河北省实验动物中心提供），随机分为8组，正常组，假手术组和VD模型组，VD模型组又分为大脑I/R2,8,24,72,168和720h组，每组8只动物。1.2动物模型制备4血管阻断法（4?VO法）〔2〕建立VD大鼠模型。假手术组麻醉及手术过程与VD模型组相同，但不电凝双侧椎动脉，不阻断双侧颈总动脉。术后按再灌注的不同时间分别将动物处死，经主动脉依次灌注生理盐水100ml和4%多聚甲醛500ml,取出脑组织，石蜡包埋切片，用于免疫组化显示Bcl?2、Bax及苏木素?伊红（HE）染色。1.3学习记忆能力的测定Morris水迷宫检测〔3〕：实验开始于VD术后4w,预先将迷宫任意分为4个象限。平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中，在大鼠游泳池边标记4点作为大鼠的入水点，记录120s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。记录各组大鼠的逃避潜伏期，作为学习记忆能力检测指标。1.4取材大鼠10%水合氯醛（3ml/kg体重）腹腔注射麻醉后，快速开胸暴露心脏，心尖取血4——5ml,分离血清，用于血清H2S含量测定；然后断头处死，并立即在冰台上开颅，迅速分离大鼠海马，用70%酒精固定，4℃冰箱保存过夜，用于流式细胞术检测。1.5HE染色切片常规脱蜡至水→1%盐酸酒精分化→伊红染色2min→切片常规梯度酒精脱水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性树胶封固。1.6免疫组化染色（SP法）Bax兔抗鼠多克隆抗体，Bcl?2兔抗鼠多克隆抗体（SantaCruz公司生产）。1.7流式细胞术检测采用美国BeckmanCoulter公司生产的Epics?XLⅡ型流式细胞仪。1.8血清中H2S含量的检测亚甲蓝分光光度法。1.9统计学处理用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。2结果2.1学习记忆能力检测结果各组大鼠在迷宫各入水点搜索平台的结果见表1,随着训练天数的增加，各组大鼠的逃避潜伏期均缩短，第2天I/R720h组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期明显延长（P0.05）。2.2VD大鼠病理形态学结果HE染色后，神经细胞胞浆呈淡红色，核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，细胞完整，结构正常，胞浆丰富，胶质细胞无增生；细胞核呈圆形、椭圆形，无变性，无固缩或溶解现象。VD模型组海马CA1区神经元排列紊乱，神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限不清，核固缩成三角形或不规则形，而且随I/R时间的延长，变性神经元数目越多，见图1.表1各组逃避潜伏期比较2.3凋亡蛋白表达结果2.3.1VD大鼠模型海马CA1区Bcl?2表达VD模型组I/R2hBcl?2蛋白平均OD值开始明显上调，I/R8h达到高峰，之后随I/R时间的延长开始下降，但I/R24h组仍高于假手术组。假手术组与I/R不同时间点组间，Bcl?2的表达情况均有显著差异（P0.05），见表3.2.6血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析随着血清H2S含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者呈现明显的负相关，回归方程为：y=-0.135x+12.06