一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111004743A(43)申请公布日2020.04.14(21)申请号201911305589.5(22)申请日2019.12.18(66)本国优先权数据201911055762.02019.10.31CN(71)申请人山西大学地址030006山西省太原市小店区坞城路92号(72)发明人马志辉杨埔张丽珍(74)专利代理机构太原市科瑞达专利代理有限公司14101代理人王思俊(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法(57)摘要一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，属于微生物领域。所述方法包括：（1）利用梯度稀释法从样品根际土壤中分离获得细菌菌株；（2）使用划线纯化方法对分离获得的菌株进行纯化，获得细菌纯培养；（3）筛选，利用改良的牛津杯法筛选拮抗细菌，特点在于使用的是半固体培养基和改良的牛津杯法，进行拮抗细菌的筛选。植物根际土壤微生物种类丰富，而细菌间则可能存在相互拮抗现象，本发明则利用快速简便的方法将可能存在的拮抗细菌筛选出来。相较现行的其他方法，操作更为简单，效果更为显著。CN111004743ACN111004743A权利要求书1/1页1.一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，其特征是包括植物根际土壤样品中细菌分离、纯化和拮抗细菌筛选；所述植物根际土壤样品中细菌的分离包括下述步骤：（1）土壤样品的处理：采集根际土壤后，加无菌水振荡处理获得菌悬液；（2）稀释液涂布平板：将菌悬液进行10倍梯度稀释，获得不同梯度的稀释液，并将不同梯度的稀释液分别涂布于R2A固体培养基，然后将平板移入28℃恒温培养箱培养；所述R2A固体培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH=7.4；（3）分离与纯化：根据平板上菌落的颜色、形态、大小特征，将特征不同的细菌单菌落挑出，在R2A固体培养基上划线，然后培养细菌；（4）对挑出的细菌菌株进行纯化，每一株细菌菌株纯化至少三次，直到获得纯菌落，依次编号，加入甘油后冷冻保存；所述拮抗细菌筛选包括如下步骤：（1）细菌菌液制备：将根际土壤中分离得到的所有菌株分别接种到R2A液体培养基中，温度是28℃，转速是180rmp摇床培养，待菌株达到对数生长后期，稳定前期后，收集菌液备用；所述R2A液体培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，蒸馏水1000ml，pH=7.4；（2）指示菌处理：使用20ml的琼脂浓度为6g/L~10g/L，PH=7.4的R2A半固体培养基，加入20μL的指示菌菌液，振荡混合均匀后倾倒平板；所述指示菌是从土壤中分离得到的细菌中选择任意一种；所述R2A半固体培养基是在R2A液体培养基中加入琼脂，琼脂浓度为6g/L—10g/L；（3）放入牛津杯：待混合菌液的R2A半固体培养基凝固后，直接在R2A半固体培养基表面垂直放置已灭菌的牛津杯，静置10min，待牛津杯自然下沉；（4）拮抗菌加入：依次在牛津杯中加入50μL待测拮抗菌菌液及50μL的无菌的R2A液体培养基；所述拮抗菌是在含有指示菌的平板上，指示菌之外的其它细菌均为拮抗菌；静置3h，移入培养箱中培养5d，观察是否有抑菌圈存在。2.根据权利要求1所述一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，其特征是所述不同梯度的稀释液是0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这6个梯度稀释液。2CN111004743A说明书1/5页一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法技术领域[0001]本发明属于微生物生态学领域，更加具体的讲，是涉及一种快速有效的筛选植物根际土壤中拮抗细菌的方法。背景技术[0002]众所周知，植物根际土壤是一个微生物种群极其丰富的环境，而不同的微生物之间可能存在多种相互作用，如拮抗，寄生，共生。[0003]研究这种拮抗现象的意义在于：首先它可以提供最直接的实验证据，证明同一生境下细菌之间确实存在拮抗作用，对微生物群落中细菌之间相互作用的研究有重要意义；其次可以应用此方法筛选对植物致病菌有抑制作用的细菌，进而可以将这些拮抗细菌应用于农业领域。那么，这就需要一种快速简便的筛选拮抗菌株的方法。[0004]目前有很多学者致力于各种抑菌现象的研究，但大多集中在真菌与真菌之间，或者真菌与细菌、放线菌之间的拮抗，对细菌之间的相互拮抗研究较少。有研究者使用传统的牛津杯法研究了一种侧孢短芽孢杆菌S62-9对常见微