酶免疫测定技术的分类.pdf

酶免疫测定技术的分类

一、非均相酶免疫测定

非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物作为抗体（抗原）的

载体，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。

（一）酶联联免疫吸附试验（ELISA）

1.原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是固相酶免疫测定技术中的一种，

其基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面，再用酶标记

的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应，加入酶

底物和色原后呈色，呈色程度（用A值表示）与待测抗体或抗原的水

平呈相关关系。此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体，读取结

果需用酶联检测仪。

ELISA试验的结果判定分定性和定量两种。定性是参比阴、阳性

对照根据有无呈色报告阴性或阳性，或根据呈色程度作出半定量

（1+～4+）报告。这种方法常受操作者的主观因素影响，只适合于大

批量体检标本的初筛。目前规定，临床标本的检测，均应用仪器测定

后报告。用于定性和定量结果判定的方法主要有：

（1）P/N比值：

即待测样本吸光度（A）值-空白对照A/阴性对照A-空白对照A。

一般以P/N≥2.1为阳性。
（2）S/CO比值：

S为待测样本吸光度（A）值，CO为Cutoff值，常以阴性对照平

均A

值×2.1代表CO值。一般以S/CO≥1.0为阳性，竞争法以S/CO

≤1.0为阳性。

（3）标准曲线单位：

将已知浓度或活性单位的标准抗原或抗体在试验系统中进行反

应，分别测定A值，以A值为纵坐标，抗原或抗体水平为横坐标，绘

制标准曲线，根据检样的A值由标准曲线获得定量单位。

2.方法

ELISA依据方法和步骤不同可分为以下几种基本反应模式。

（1）间接法：

用于检测样本中特异性抗体。将已知特异性抗原包被于聚苯乙烯

板微孔，形成固相抗原；洗弃未交联的抗原（洗板，下同）；加稀释

的待检样本，若其中含特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原-抗体

复合物；洗弃未反应的成分，加酶标记抗抗体（一般为酶标记抗人

IgG、抗人IgM或葡萄球菌A蛋白），使在固相载体上形成抗原-待检

抗体-酶标记抗体复合物；洗弃未反应的成分，加酶底物-色原呈色，

在一定波长下测A值判定待测抗体的有无和水平。该法主要用于抗体

的检测，其优点是酶标抗体具有通用性，具体实验步骤如下。
1）将已知抗原包被固相载体，形成固相抗原。封闭其余空白位

点。

2）加待检血清（Ab），待检抗体与固相抗原发生特异性结合，经

洗涤除去其他未结合成分。

3）加酶标抗抗体，反应后形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体

的复合物。游离的标记抗体经洗涤除去。

4）加底物显色，通过颜色深浅对待检抗体进行定量。

（2）双位点一步法：

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗

原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可

使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但

简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定

的敏感性和特异性也显著提高。具体步骤如下。

1）将一种单克隆抗体与固相载体连接，形成固相抗体，随后再

用某种蛋白质封闭空白位点。

2）加待检标本（Ag）和另一种酶标单克隆抗体，该抗原将同时

与二者发生特异性结合，形成固相抗体-待检抗原-酶标抗体的夹心复

合物，其他未结合物质经洗液除去（由于固相抗体和酶标抗体为识别

同一抗原分子上不同的抗原决定基，两种抗体之间不会形成竞争）。

3）加底物显色，通过颜色的深浅，计算标本中抗原的含量。
该法特点是省时、简便、特异性高。但有时可出现钩状效应（hook

effect）。一步法要求两种单克隆抗体所识别的抗原位点应相距一定

距离，以确保两种反应不相互干扰。因此，该方法使用的两种抗体应

进行选择。

（3）竞争法：

用于检测待检样本中未知抗原或抗体。测抗原时用已知抗体包被

固相载体，然后同步加入含有待测抗原的样本和酶标记抗原，使待测

抗原与酶标记抗原竞争结合在固相载体上的抗体；洗板；加酶底物-

色原呈色。待测溶液抗原量越多，则被结合的酶标记抗原量越少，呈

色越浅，呈色深浅与待测抗原的量成反比。测未知抗体时用已知抗原

包被固相载体，同步加入含有待测抗体的标本和酶标记特异抗体，二

者竞争结合固相载体上的抗原，待测抗体量越多，酶标记抗体与固相

抗原结合的量就越少，呈色就越浅，待测抗体的水平与呈色程度成反

比。

下面以测定抗原为例，说明其操作步骤，简述如下：

1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与

固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗

体结合。如受检标本