免疫荧光染色.pdf

一、免疫荧光标记技术：免疫荧光（immunofluorescencetechnic）
Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记
抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物
示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为
荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋
白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所
以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织如检查未知抗原，先用已知未标记的特
异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的
抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用
水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原
标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血
清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊
断。免疫组织化学：
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的
原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显
色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，
称为免疫组织化学。主要过程免疫组织化学的全过程包括：
1.抗原的提取与纯化；
2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；
3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；
4.标本的制备；
5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；

6.观察结果。
应用的基本原则

免疫组织化学染色在生物医学研究中具有十分广泛的作用。并且涉及许多研究
领域。但是，免疫组织化学技术也有其局限性，例如，组织细胞内的待测物质要
有抗原性，而且需要有一定浓度方可检出；检出的免疫反应阳性蛋白不能被确定
是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白，因此，在实验设计中应充
分考虑这些特点。如果实验需要证明已知蛋白为何种细胞合成，需采用分子原位
杂交技术解决。为引导初学者在实验设计中合理巧妙地运用免疫组织化学技术，
将其应用的基本原则简述如下：
1．确定细胞类型和形态组织细胞内有些蛋白具有组织特异性，如胶质原纤维
酸性蛋白（gialfibrillaryacidicprotein，GFAP）只存在于星形胶质细胞内．神经
丝蛋白（Neurofilament，NF）只存在于神经细胞内。通常把这些具有组织特异
性的蛋白称为标记性蛋白
（Proteiniliaker）。通过标记性蛋白的特异性抗体可确定细胞种类。有些细胞（如
表皮内朗格汉斯细胞和黑色素细胞等）在光镜下不易辨认，通过对胞质内的特定
蛋白实施免疫组化染色，便能清楚显示此类细胞外形轮廓。这种作用在神经科学
研究和肿瘤临床病理中显得尤为重要。
2．辨认细胞产物的来源利用某些细胞产物为抗原，制备相应的抗体，对组织
细胞实施免疫组织化学染色，以确定细胞产物的来源。如内分泌细胞产生的各种
激素，大多数可用免疫组化染色技术辨认，据此可研究细胞的分泌功能及对内分
泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等，了解细胞分化程度。

免疫组织化学染色法（DAB显色）
3．确定细胞的分化程度分化程度不同的同一类细胞多表达不同的标志性蛋白，
根据对这些不同蛋白的鉴定可确定细胞的分化程度。例如，神经上皮细胞的标志
性蛋白是巢蛋白（nestin），当其分化为放射状胶质细胞时表达波形蛋白
（vimentin）。在神经元发生期分化为成神经细胞时则表达Ⅲβ神经微管蛋白
（TUJl），成神经细胞分化为成熟的神经元时表达神经丝蛋白（neurofilament，
NF）。
4．追踪神经纤维束和它的投射区用于此目的的免疫组织化学方法常与轴浆运
输示踪法相结合来研究神经元之间的联系。轴浆运输示踪法是利用某些物质可被
神经末梢摄取。经轴质逆行运输到胞体的特点．用组织化学方法显示出神经元的
轮廓。常用示踪剂有辣根过氧化物酶和荧光金等。例如。为观察周围神经系统或
中枢神经系统某核团神经纤维投射．先将示踪剂注射到动物神经纤维末梢部位，
使动物存活一段时间，在预期神经纤维投射部位取材，先通过组织化学方法使示
踪剂定位，再实施免疫组织化学方法确定其性质。
5．在临床病理中的应用如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分
化表型，
[1]确定肿瘤分期，指导治疗和预后。辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因