一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105586398A(43)申请公布日2016.05.18(21)申请号201510498425.4(22)申请日2015.08.13(71)申请人北京工商大学地址100048北京市海淀区阜成路33号(72)发明人董银卯李萌王巧娥孙明安丽源(74)专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨韩小雷(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图1页(54)发明名称一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法(57)摘要本发明公开了一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法，包括以下步骤：(1)收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，提取总DNA；或者从芦荟食品中提取芦荟凝胶总DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用SEQIDNO:2和3所示引物进行PCR扩增反应，扩增ITS序列；(3)PCR产物进行直接测序；(4)利用MEGA4.1软件对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育树，根据序列比对和聚类分析结果鉴定库拉索芦荟品种。其中，所述的ITS序列来源于库拉索芦荟的rDNAITS序，是位于18S和26SrRNA之间的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明的方法操作简单易行，可达到方便、快速、客观、准确区分库拉索芦荟与其他芦荟品种的目的。CN105586398ACN105586398A权利要求书1/1页1.一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，提取总DNA；或者从芦荟食品中提取芦荟凝胶总DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用SEQIDNO:2和3所示引物进行PCR扩增反应，扩增ITS序列；(3)PCR产物进行直接测序；(4)利用MEGA4.1软件对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育树，根据序列比对和聚类分析结果鉴定库拉索芦荟品种。其中，所述的ITS序列来源于库拉索芦荟的rDNAITS序列，是位于18S和26SrRNA之间的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，进行切割处理后置于柔软且透气性较好的纸袋，并放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥；或者收集健康新鲜芦荟样品的成熟叶片，进行切割处理后放入一次性培养皿中，用保鲜膜封好，-20℃冷冻至芦荟叶片冷冻完全，随后放入冻干机中冷冻干燥24h，后放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的硅胶是粉末状的直径为20～30A的白色硅胶与蓝色变色硅胶的混合物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应的反应体以25μL计为：5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。6.一种ITS序列在鉴定库拉索芦荟品种中的应用，所述的ITS序列来源于库拉索芦荟的rDNAITS序列，是位于18S和26SrRNA之间的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2CN105586398A说明书1/6页一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法技术领域[0001]本发明涉及一种鉴定芦荟品种的方法，特别涉及一种利用ITS序列鉴定库拉索芦荟品种的方法，属于植物种质资源的鉴定技术领域。背景技术[0002]芦荟(Aloe)是一种长绿多肉质草本植物，隶属于多年生单子叶植物纲(Monoctyledoneae)天门冬目(Asparagales)独尾草科(Asphodelaceae)。该科以前的分类法中大部分属分在百合科(Liliaceae)内，被列为亚科。芦荟属(AloeL.)为1754年瑞典分类学大师林奈的建立的，发表在他的经典著作《植物属志》第五版。1980年出版的《中国植物志》14卷(百合科)，将芦荟属隶属于广义的百合科中。百合科有230个属，3500个种，本属内有300余种。[0003]芦荟的用途很广，它的有效成分对人体有特殊保健功能和抗肿瘤的作用，目前已广泛应用于保健品、化妆品、食品、观赏和药物工业上。芦荟属(AloeL.)植物种类繁多，变异多样，种质资源异常丰富，传统的芦荟种分类主要依据是形态学、细胞学。根据形态学进行分类比较直观。但由于芦荟和近缘属间杂交可育，不断出现一些新的属间杂交种；且芦荟属内同名异种和异名同种现象多有发生，造成不同种或亚种间的亲缘关系比较混乱，形态学有时难以反映种间的遗传差异和亲缘关系。而有关其种间