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新型光学成像技术——双光子荧光显微镜

光学成像技术一直以来都是生物学研究的重要手段。传统的荧
光显微镜通过荧光标记物的发光来研究生物分子和细胞的功能，
但由于深度限制和荧光标记对细胞和生物体的影响，限制了研究
深度和准确程度。然而双光子荧光显微镜的出现改变了这个现状，

具备高分辨率、深度成像和非侵入性标记等特点。

一、双光子荧光显微镜的原理

双光子荧光显微镜的成像原理是利用非线性荧光效应——双光
子激发荧光效应，当两个光子的能量合成能够与荧光分子的跃迁

能量匹配时，荧光分子受到激发，发生荧光发射。

与传统的单光子激发荧光不同，双光子激发荧光只在聚焦点产
生明显的荧光信号。这是因为在双光子激发荧光中，荧光产生需
要两个光子的同步作用。这种非线性过程不利于在样品各个层次
产生荧光信号。因此，在使用双光子荧光显微镜进行样品成像时，
只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，从而能够获得更高

的分辨率和更深的成像深度。

二、双光子荧光显微镜的特点

1.非侵入性成像

传统的荧光显微镜需要生物体或细胞中荧光标记物的标记才能
进行成像。而双光子荧光显微镜不需要使用任何外部标记物，可
以直接在生物体中进行成像。这种非侵入式成像能力使得双光子
荧光显微镜在活体成像和组织工程等应用方面有着广阔的应用前

景。

2.高分辨率成像

由于双光子荧光显微镜的成像原理，只在聚焦点周围的小范围
内进行信号的检测，能够获得更高的分辨率。深度成像时，同样

具备更高的分辨率，在成像深度达到300μm时，其分辨率保持在

数百奈米量级。

3.深度成像

双光子荧光显微镜能够获得更深的成像深度。传统的荧光显微
镜在成像深度达到几十微米之后，即使在同样的条件下，荧光信
号的强度会急剧减弱，因此限制了深度成像的应用范围。而双光

子荧光显微镜能够在成像深度达到1mm时，仍然能够获得较高的

荧光信号强度和分辨率。

三、双光子荧光显微镜的应用

1.细胞成像

双光子荧光显微镜能够对单个细胞进行成像，展示细胞内分子

的构成和运动过程，以及细胞能量代谢和信号传递的机制等。

2.活体成像

双光子荧光显微镜能够在活体中进行成像，例如观察小鼠脑活

动、心肌代谢等，对观察生物体内部过程具有极大的帮助。

3.神经系统成像

双光子荧光显微镜在成像神经系统方面具有很大的应用价值。
通过对神经元和突触的成像和跟踪，能够研究神经网络的形成和

发展，以及神经发生性疾病的机制等。

四、发展趋势

随着双光子荧光显微镜的进一步发展和应用，其在医学、生物
学等领域的重要性将会越来越大。研究人员的目标是进一步提高
双光子荧光显微镜的分辨率和成像深度，以及丰富其成像模式，

使之更好的服务于生物医学研究和医学临床应用的需要。

总结

双光子荧光显微镜的出现，使得我们能够直接观察细胞层面的
生命机制，并且解决了以往传统荧光显微镜局限的问题，实现了
深度成像、非侵入性成像以及高分辨率成像等重要功能。未来，
双光子荧光显微镜将会进一步发展，成为生命科学和医学领域的

重要研究工具。