一种抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105505981A(43)申请公布日2016.04.20(21)申请号201511022465.8C12Q1/68(2006.01)(22)申请日2015.12.30(83)生物保藏信息CGMCCNo.116862015.12.29(71)申请人中国农业科学院作物科学研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号重大工程楼501室(72)发明人邱丽娟郭兵福郭勇张丽娟洪慧龙金龙国王爽杨慧(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅白艳(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表13页附图5页(54)发明名称一种抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了一种抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用。本发明提供了一种培育转基因大豆的方法，为将外源DNA片段插入目的大豆基因组第19号染色体的第50,543,767-50,543,792位间，得到转基因大豆。本发明的转基因大豆对高剂量的草甘膦具有耐受性，可进一步通过与优良大豆株系杂交来改良以优化其他农艺性状如产量、品质等。本发明的检测方法可以鉴定插入的T-DNA和植物基因组DNA的结合区域并进一步鉴定转基因大豆及其后代的细胞、组织、器官、制品等。CN105505981ACN105505981A权利要求书1/2页1.一种培育转基因大豆的方法，为将外源DNA片段插入目的大豆基因组第19号染色体的第50,543,767-50,543,792位间，替换掉第19号染色体的第50,543,767-50,543,792位间24bp的碱基序列，得到转基因大豆；所述转基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆；所述外源DNA片段为含有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因和N-乙酰转移酶基因的DNA分子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因为G2-aroA；所述N-乙酰转移酶基因为GAT；所述外源DNA片段为序列表中序列10或序列1自5’末端第6217-10855位核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段为所述目的大豆基因组第19号染色体的自第50,543,767位核苷酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段；所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段为所述目的大豆基因组第19号染色体的自第50,543,792位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述上游侧翼片段为序列表中序列8所示的核苷酸；所述下游侧翼片段为序列表中序列9所示的核苷酸。5.根据权利要求1-4中任一所述方法，其特征在于：；所述外源DNA片段通过含有所述外源DNA片段的重组载体导入所述目的大豆；所述重组载体的核苷酸序列具体为序列表中序列1；所述目的大豆为大豆品种Jack。6.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1-5任一所述方法制备的的转基因大豆或其后代或用于检测或辅助检测制品是否含有权利要求1-5任一所述方法制备的的转基因大豆或其后代的方法，包括如下步骤：检测所述植物样品或制品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，所述DNA片段A为如下1)或2)：1)由权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段、权利要求3中的所述外源DNA片段和权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段组成；2)与1)所示的DNA片段A同源性大于95％的DNA片段；若含有所述DNA片段A，则所述植物样品或制品为或候选为所述转基因大豆或其后代；若不含有所述DNA片段A，则所述植物样品或制品不为或候选不为所述转基因大豆或其后代。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法为如下1)或2)或3)：1)直接测序植物样品或其制品的基因组DNA，判断所述测序植物样品或制品中是否含有所述DNA片段A；2CN105505981A权利要求书2/2页2)用引物对1或引物对2进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品或制品含有所述DNA片段A；所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其的所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其的所述下游侧翼序列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙；3)用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述待测植物样品或制品D