小鼠基因功能研究及疾病模型系列专题_二_基因工程小鼠.pdf

,neseouaoeoo:一..中国细胞生物学学报ChiJrnlfellBilgy201032(2)193194httP:/wwwcjeborg小鼠基因功能研究及疾病模型系列专题(二)基因工程小鼠的品系管理及基因型鉴定—高翔*(南京大学模式动物研究所,南京210061)实验室基因工程小鼠品系的保存大多是通过和(neomyeinresistantgene)序列的通用PCR引物鉴定野生型小鼠交配,然后不断鉴定、选择携带基因突经典基因剔除小鼠。如果该实验室只有一两种基因,。变或转基因的后代来实现。因此,维持一个基因工剔除品系这样做是可以的但是当实验室同时饲程小鼠品系,必须要通过分子生物学手段不断的鉴定养多个品系时,这种方法很可能会导致品系之间的,小鼠的基因型。以基因剔除小鼠为例,一般我们需基因型鉴定结果的交叉污染所以我们还是建议使,要设计两组不同的PCR引物分别用于扩增野生型小用品系特异的PCR引物对基因剔除小鼠进行基因型。。鼠和突变型小鼠的基因组DNA片段用于扩增野生鉴定型基因组DNA的PCR两个引物至少有一个来自于被遗传工程小鼠品系的个体动物管理和记录也是,,剔除的区域DNA序列这样对于基因剔除小鼠纯合非常重要的因此笼盒标牌上一般要标注至少品系、、、、子个体基因组DNA,利用这对引物将无法得到扩增产名小鼠编号基因型性别出生日期和品系,。,物;用于扩增突变型小鼠基因组DNA我们一般在被管理人等信息和普通小鼠不同每个遗传工程小。。,剔除片段的两端设计PCR引物由于被剔除的片段鼠均有其唯一编号目前对小鼠编号有许多方法,,大多有成百上千个碱基这样通过PCR产物大小可以如在耳朵和脚趾剪记号等大型实验动物设施也可以。,明显区分突变型小鼠和野生型小鼠来源的DNA片段采用皮下植入条码的方法基于简单易行的原则(野生型小鼠相应片段常常由于过长而不被扩增)。我们实验室目前还是采用剪脚趾对小鼠进行编号。,,一般来说用于基因型鉴定的PCR产物大多在这个方法可以将编号1到99的小鼠区分开来对于,,300一800bp左右最好能将野生型基因鉴定PCR产编号大十100的小鼠我们可以在笼盒的标牌上注,。物大小和突变型基因鉴定PCR产物大小分开这样在明具体标注见下图(腹面观):,观察电泳结果时可以一目了然。鉴于动物福利管理规范我们要求所有的剪趾编,值得一提的是有些实验室常常使用针对Neo号及剪尾(用于提取DNA进行基因型鉴定)操作必须30802090l0一98,A编号注明B示例#11圆圈为应剪脚到C示例#47,圆圈为应剪脚趾。一,一.*通讯作者Tel:02558641532Email:gaoxiang@川uedu￡n··专题介绍e在小鼠出生后8到12天之内完成(鼠尾剪取长度不得Digstionbufer(500ml):终浓度·.超过0.5厘米),这一方面避免了在幼仔出生后一周打1moljLTrisHCI(PHS0)25150mo比..扰带乳母鼠,防止母鼠的吃仔现象,同时这时的小鼠05mo比EDTA(PH80)100Inl100mol/L,,,.容易抓取体毛尚未生长出血也较少提取的DNANaCI292591(X)mo比。,质量较好更重要的是在花费1~3天完成基因型10%SDS50mll%,。。鉴定后,我们可以保证在小鼠分笼之前知道各只幼鼠加水至500ml定容室温保存的基因型,从而可以在分笼是按试验设计或传代要求,蛋白酶K保存液(10mglmlinMilliQ水):,。,。牺牲不需要的小鼠避免占用过多笼位1ml分装一20℃保存,.提取鼠尾DNA的方法有很多种以下是我们实Tris平衡酚(pH80):(IL),,验室采用的两种方法。其中高盐提取法快捷,但提500ml固态酚60℃水浴融化(内盖打开)转移。。取的DNA质量有时不能满足特定品系鉴定的需要至大锥形瓶中。。这时可以改用酚/氯仿法提取加入等体积(500ml)的MilliQ水,一.。(A)酚/氯仿提取法加入309Tris198经基喳琳(终浓度01%)第一天摇晃,静置分层。.,,,,。1剪取0.5cm鼠尾(同样适用于脚趾胚胎组织卵用Tris调上清液至pH8.0混匀分装4℃保存.。黄膜等),放入15ml离心管酚/氯仿(1:l):.,。2按500林1digestionbufer+5林l蛋白酶K的比例等体积的Tris平衡酚(下层)。配制鼠尾消化液等体积的氯仿。.。3将保存液每管500川加入离心管,5℃的水浴剧烈摇晃混匀,静置分层,。。中消化过夜4℃保存(注意:使用时吸取下层液体!)第二天(B)高盐提取法.。4用劲将消化好的组织摇匀第一天.,,5每管加入500川酚/氯仿(l:l事先配好4℃同酚/氯仿提取法。保存)第二天.,,,。.。6混匀离心12000r/min10min1用劲将消化好的组织摇匀...。7转移400哪上清液至新的标