检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107083441A(43)申请公布日2017.08.22(21)申请号201710444371.2(22)申请日2017.06.13(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪11号(72)发明人储岳峰朱建勋陈胜利赵萍郝华芳刘永生季文恒翟肖辉(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350代理人汤东凤(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12R1/35(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒(57)摘要本发明公开了检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒，它属于分子生物学检测领域。PCR试剂盒包含引物和探针,引物为：Mccp-specific-Forward：5′-GTAGCAGCTATATTCTTAATCA-3′，Mccp-specific-Reverse：5′-GCTACAAATAATTCTTGCATAC-3′，探针为：Mccp-specific-Probe：5′-F-AAGTAATACCAGCAGCAACAGCAAG-Q-3′，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团，探针5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团TAMRA。试剂盒检测结果重复性较好，检测方法稳定，数据可靠。CN107083441ACN107083441A权利要求书1/1页1.检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的PCR试剂盒包含引物和探针，所述的引物为：Mccp-specific-Forward：5′-GTAGCAGCTATATTCTTAATCA-3′Mccp-specific-Reverse：5′-GCTACAAATAATTCTTGCATAC-3′。2.根据权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述探针为：Mccp-specific-Probe：5′-F-AAGTAATACCAGCAGCAACAGCAAG-Q-3′，其中F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团，且所述的探针5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团TAMRA。3.根据权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)，ROXReferenceDyeII(5×)和Nuclease-freewater。4.根据权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性标准模板，所述阳性标准模板为构建的pMD18-T/arcD阳性质粒，该质粒是引物扩增的山羊支原体山羊肺炎亚种arcD基因的部分序列，所述的基因序列为GCTCAATTTTATTAGCAATTGTTAACTCTTTAGGAGAAGAAAAATTTATTAAAGAATTTATGGCTGGTGCTTGCGATCTTTTAGGAGTATGTTTAGTTGAATATTAAAAGTAACG注：字体加粗且有下划线的序列为上下游引物，字体加粗且有着重号的序列为探针反向互补序列。长度为185bp，克隆至pMD18-T载体，命名为pMD18-T/arcD。5.根据权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的使用方法为：步骤一、提取样品组织中的总DNA；步骤二、以步骤一中的总DNA为模板，Mccp-specific-Forward和Mccp-specific-Reverse为引物，Mccp-specific-Probe为探针，进行实时荧光定量PCR扩增反应；步骤三、分析数据，包括标准质粒和模板DNA的Cq值、拷贝数及标准曲线相关参数，其中，TaqMan探针实时荧光定量PCR反应体系为20μL，各物质浓度及用量为：PremixExTaq2×10μL，Mccp-specific-Forward(10uM)各0.4μL，Mccp-specific-Reverse(10uM)各0.4μL，Probe(0.5uM)0.8μL，RoxReferenceDyeⅡ5×0.2μL，ddH2O6.2μL，DNATemplate2μL，其中TaqMan探针实时荧光定量PCR反应采用两步法扩增程序：Stage1：95℃预变性30s；Stage2：95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。2CN107083441A说明书1/5页检测山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR试剂盒技术领域：[0001]本发明涉及分子生物学检测技术领域