快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107119139A(43)申请公布日2017.09.01(21)申请号201710446999.6(22)申请日2017.06.14(71)申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院蔬菜花卉研究所(72)发明人明军袁素霞曹雨薇徐雷锋杨盼盼(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表2页附图1页(54)发明名称快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的方法(57)摘要本发明涉及病原真菌技术鉴定领域，它涉及基于PCR分子检测灰霉病病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的特异性引物对。本发明解决的技术问题是提供特异性扩增引物对采用分子鉴定方法，快速检测百合灰霉病病原菌灰葡萄孢。不仅克服了传统真菌形态鉴定周期长、主观性强的缺点，而且，克服了ITS通用引物鉴定不特异准确的问题，达到了百合灰霉病发病初期高效准确鉴定，尽早采取准确高效防治措施，有利有效控制病情的目标。本发明用于扩增灰葡萄孢的特异性引物对命名为B.cinF/B.cinR。本发明的引物对能够准确扩增出灰葡萄孢的特异目的片段。CN107119139ACN107119139A权利要求书1/1页1.快速检测百合灰霉病致病病原菌——灰葡萄孢的方法，其特征在于：用于检测灰葡萄孢的特异性引物对的PCR扩增体系为20μL：模版DNA2μL，B.cinF0.5μL，B.cinR0.5μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，ddH2O7μL。2.根据权利要求1中所述的快速检测百合灰霉病致病病原菌——灰葡萄孢的方法，其特征在于用于检测灰葡萄孢的特异性引物对的PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃30s，55.7℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。3.根据权利要求1中所述的快速检测百合灰霉病致病病原菌——灰葡萄孢的方法，其特征在于用于检测灰葡萄孢的特异性引物对命名为B.cinF/B.cinR，正向引物B.cinF的碱基序列为5′-CCCGAGCTAATTTATGTTTTGC-3′，反向引物B.cinR的碱基序列为5′-GAGCCGAAGAAAGAGTAATG-3′，目的片段长度为742bp。2CN107119139A说明书1/3页快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的方法技术领域[0001]本发明涉及病原真菌鉴定技术领域，涉及一种用于快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的特异性扩增引物对。背景技术[0002]百合是百合科(Liliaceae)百合属(Liliumspp.)多年生草本球根植物。百合是较易感病的植株，其中百合灰霉病是危害百合较为严重的病害之一，严重危害百合的生长及品质，对叶片及花蕾危害最为严重，随着带菌种球栽植面积的逐渐扩大和常年连作的种植方式，病害发生程度日趋严重，危害范围逐渐扩大，成为严重危害百合生产中的重要病害之一(朱丽梅等，2009；2012)。[0003]灰霉菌是引起百合灰霉病的病原菌，灰葡萄孢(Botrytiscinerea)是主要的病原菌之一，叶缘干枯型发主要致病菌为灰葡萄孢，分离率为93.7％。灰霉菌主要危害的是百合叶片，由叶片或叶缘开始逐渐向整个叶片发病，在叶片上形成圆形或者椭圆形病斑，病斑呈褐色，最后使叶片畸形枯死，甚至整个叶片干枯、坏死。潮湿环境时，病斑有灰色霉层，后有黑色菌核生成。茎部染病时出现黄褐色或者红褐色条形病斑，茎基部缢缩、倒折，形成“一边倒”弯曲势，叶片沿茎基部逐渐向上枯萎脱落，鳞茎染病可引起整个植株腐烂(徐琼等，2006)。[0004]真菌鉴定主要有传统真菌形态学鉴定和分子生物学鉴定。传统的真菌形态学鉴定周期长，过程复杂，而且专业性强，操作人员主观意识较强。分子生物学鉴定主要采用真菌rDNA-ITS序列设计的通用引物，ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)、ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)进行扩增(Whiteetal.，1990；陈凤毛，2007)，由于可扩增出大多数担子菌和子囊菌，特异性不强，因此还需要进一步测序进行比对，鉴定周期长，测序费用昂贵，给病菌鉴定带来一些困难，因此存在缺陷，需要提高改进。[0005]本专利提供了快速扩增百合灰霉病病原菌灰葡萄孢的特异性扩增引物对，可一次扩增反应快速准确检测出百合灰葡萄孢致病菌，缩短鉴定周期，降低检测费用。[0006]主要参考文献：[0007]1)朱丽梅，侯建文，罗凤霞，蒋倩倩.百合灰霉病的诊断及其病原物