一种大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法和功能验证.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107641624A(43)申请公布日2018.01.30(21)申请号201611218485.7C07K14/415(2006.01)(22)申请日2016.12.26C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2018.01)(71)申请人华南农业大学A01H6/54(2018.01)地址510642广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人张秀香年海唐平孟醒闵祖辉宋瑞凤(74)专利代理机构广东广信君达律师事务所44329代理人杨晓松(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12N15/60(2006.01)C12N9/88(2006.01)C12N15/29(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图3页(54)发明名称一种大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法和功能验证(57)摘要本发明公开了一种大豆耐低磷基因Gm100776332及其克隆方法和应用，属于资源与环境技术领域。本发明通过差异蛋白质组学探索大豆基因组中糖酵解途径的相关基因，在低磷条件处理下，运用qPCR技术测定华春5号和瓦窑黄豆的表达量进行测定。运用差异蛋白组学和qPCR技术最终筛选到了差异明显的Gm100776332基因，克隆了大豆耐逆基因Gm100776332，并通过转化拟南芥对其耐低磷的关键性指标-可溶性糖含量进行测定。CN107641624ACN107641624A权利要求书1/1页1.一种耐低磷基因Gm100776332的克隆方法，其特征在于：应用引物F如SEQIDNO：2所示；引物R如SEQIDNO：3所示，进行反转录PCR，94℃3min预变性，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环后72℃再延伸10min；在栽培大豆华春5号中克隆Gm100776332。2.一种耐低磷基因Gm100776332，其特征在于：由权利要求1所述的克隆方法获得，所述的大豆耐低磷基因Gm100776332的核苷酸基因序列如SEQIDNO：1所示。3.如权利要求2所述的大豆耐低磷基因Gm100776332，其附加技术特征在于：在参与耐逆途径中的应用。4.根据权利要求3所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在参与耐低磷途径中的应用，其特征在于：通过采用转基因拟南芥来实现大豆耐低磷基Gm100776332调节的应用。5.根据权利要求4所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在参与调控糖酵解途径中的应用，其特征在于：所述的采用转基因拟南芥为采用花药侵染法转化拟南芥来实现。6.如权利要求5所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在参与调控糖酵解途径中的应用，其具体包括以下步骤：(1)大豆耐逆基因的发掘：华春5号大豆种子表面消毒，将消毒过的种子种于石英砂中，发芽后待幼苗长出真叶(真叶展开)时，选择长势一致的幼苗移至含不同磷浓度1/2Hoagland营养液中继续培养。然后将植株转至无磷的液体培养液中处理48h时，取2cm左右的大豆根尖。提取蛋白质，通过iTRAQ检测及数据分析，以及利用qPCR方法进一步验证，qPCR与iTRAQ技术获得相同的结果。均发现PDC在各个时间点的表达量都发生明显的变化。通过NCBI找到该基因，命名为Gm100776332；(2)大豆Gm100776332基因的克隆：取iTRAQ测定的同一批大豆根尖材料，然后用TRIzol提取法进行RNA的提取并反转录成cDNA，克隆出了Gm100776332的CDS序列。它的长度为1812bp，包含了277bp的5’非翻译区，214bp的3’非翻译区和1812bp的开放式阅读框。测序后进行比对，Gm100776332的序列和William82参考序列一致。连接pZeroBack/Bluntvector载体进行测序；鉴定正确后转化农杆菌中；(3)拟南芥为载体来实现大豆耐逆基因Gm100776332参与耐低磷调节试验：首先进行拟南芥的遗传转化，Gm100776332基因转化拟南芥阳性植株的筛选，转拟南芥耐低磷的基因时间点qPCR验证。本研究为了进一步了解Gm100776332的功能，我们构建了过量表达载体对拟南芥进行异源转化。得到的T0代种子经含有20mg/L潮霉素的筛选培养基中培养，10天后把具有抗性的苗移入营养土中。得到T1代后，取以上20株T1代植株叶片提取基因组总DNA，用质粒DNA作阳性对照，野生型植株DNA和水作阴性对照，扩增潮霉素基因。初步证明了目的基因Gm1007763321已整合在拟南芥的基因组中。同时进行了野生型拟南芥和转基因拟南芥植株可溶性糖含量的测定，转基因拟南芥的表达量较野生型有了明显的提高。因此，通过此次实验，推测该基因可能参与大豆耐低磷机