植物原生质体融合技术.ppt

第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion微丝◆What基本原理◆Why技术应用◆How技术方法第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion一、植物原生质体的制备1、原生质体的概念及培养的意义植物原生质体在理论研究和细胞工程中的地位纯化后的叶肉原生质体2、原生质体材料来源3、原生质体的分离A、原生质体的分离方法B、影响原生质体数量和活力的因素C、分离原生质体所用的酶液和稳定剂4、原生质体的纯化例:烟草叶肉细胞原生质体的分离1).材料的准备与消毒2).酶解3).纯化分离、洗涤、纯化原生质体的试剂4).原生质体的活力测定FDA法的原理原生质体分离纯化流程图第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion二、植物原生质体的培养固体培养法原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察浅层液体培养法：在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养双层培养法在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基2、原生质体的培养程序3、原生质体培养成功的技术关键第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion回顾：动物细胞融合技术简介三、植物原生质体的融合1、植物细胞融合的概念和意义2、植物细胞融合的程序3、诱导原生质体融合的方法及融合剂回顾：诱导动物细胞融合的方法A.盐类融合法B.高Ca2+和高pH值融合具体做法(以烟草为例)C.聚乙二醇（PEG）融合法D.PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法PEG诱导原生质体融合过程E.电融合法电融合基本过程细胞电融合过程原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。4、细胞融合的影响因素5、杂种细胞的选择和鉴定A、融合体的类型B、杂种细胞选择的方法生长特性选择法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。物理特性选择法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种。其他方法：如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色C、细胞杂种的鉴定18条染色体几种细胞融合成功的例子番茄+马铃薯1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato)THEEND