甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108575738A(43)申请公布日2018.09.28(21)申请号201810567576.4(22)申请日2018.06.05(71)申请人南充市农业科学院地址637000四川省南充市顺庆区农科巷137号(72)发明人余青青邓武明田露申杨玉恒宋稀代兵兵赵昌斌黄成云(74)专利代理机构成都方圆聿联专利代理事务所(普通合伙)51241代理人李鹏(51)Int.Cl.A01H1/08(2006.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法(57)摘要本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，小孢子提取、灭菌后培养，离心留下层沉淀，再次培养、清洗离心，进行低温热分散间歇微波辐照处理；将处理后培养液离心沉淀，32℃下暗培养，换液培养，然后转入25℃暗培养；待长胚状体后，振荡暗培养；长出子叶型胚状体在MS培养基成苗；成苗材料进行继代培养，10月初炼苗移栽入大田。本发明用微波作诱变剂，具实验设备简单、对环境无危害等突出优势；在小孢子培养过程中增加步骤，可操作性强；诱变对象为单倍体敏感期的单一细胞，其诱变效率较诱变种子高；小孢子培养产生的DH系为纯合双二倍体，隐性突变性状当代可表达，变异性状筛选快捷、高效。CN108575738ACN108575738A权利要求书1/1页1.甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)小孢子提取，于田间选取被培养材料3-4mm大小花蕾30个，将花蕾装在球形茶叶滤器中放入10-15％NaCLO液体中，再加2-3滴吐温20灭菌20分钟，无菌水清洗3次；(2)将灭菌后花蕾转入蒸发皿中，加入少量NLN-13液体培养基，用玻棒捣碎，转入带滤网的漏斗中过滤至10ml离心管；(3)将此10ml离心管1000转离心5分钟，留下层沉淀，再次加入NLN-13液体培养基，清洗离心，共清洗2次；(4)将清洗后小孢子细胞进行低温热分散间歇微波辐照处理；(5)将处理后培养液离心沉淀，再加入含200-300mg/L秋水仙碱NLN-13液体培养基20ml，分装到三角瓶，每瓶10ml；(6)32℃下暗培养24小时；(7)换液培养，收集前一天培养的小孢子，500转离心5分钟并清洗1-2次，分装到无秋水仙碱的NLN-13液体培养基20ml中，用d＝90mm培养皿存装，5ml/皿，放入32℃培养箱中培养2天；(8)转入25℃暗培养；(9)待长出肉眼可见胚状体后，25℃、60转/min振荡暗培养；(10)长出子叶型胚状体在MS培养基成苗；(11)成苗材料进行继代培养，10月初炼苗移栽入大田。2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法，其特征在于，步骤(4)低温热分散间歇微波辐照处理的方法为，将装有小孢子细胞培养液的离心管放入装有冰水混合物的不透明盒子内，将盒子整个放入微波炉内进行微波辐照，辐照到冰水混合物中冰全部融化为止，再更换新的冰水混合物盒子，继续辐照处理，处理时长累计200S。2CN108575738A说明书1/4页甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法技术领域[0001]本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜游离小孢子培养微波诱变方法。背景技术[0002]油菜是我国最重要的油料作物之一，产量和播种面积均居世界首位。目前，甘蓝型油菜在我国广泛种植，其种质资源主要来自欧洲，遗传背景比芸薹属其他作物狭窄，遗传基础薄弱，所育成品种利用的基因集中到少数有利用价值和适应优势的种质上，制约了我国甘蓝型油菜的育种工作。因此，利用先进技术对现有的种质资源进行创新，拓宽遗传基础在当今油菜研究领域具有重大意义。[0003]诱变育种作为种质资源创新和农艺性状改良的重要手段之一，已在油菜育种中发挥重要作用。国内外众多学者(Thuling，1992；Tonnemake，1992；董遵等，2003；石淑稳等，1995；李加纳等，1997；周永明等，1998；曲高平等，2014)曾用X、射线、中子、β射线、UV紫外线、离子束和热中子以及各种化学诱变剂处理种子，分别获得了早熟、长角果、高含油量、低亚麻酸、低硫苷、低芥酸、高油酸和抗除草剂等突变体。[0004]诱变种子是最简便的诱变方法，但突变体的选择只能在M2代后进行。由多基因控制的性状需要多代自交后方能稳定，隐性突变基因易丢失，且突变体的获得需要的年限长，田间鉴定所需群体大、效率较低。而单倍体离体诱变很好解决了上述问题，日益成熟的油菜小孢子培养更是促进了诱变育种技术发展。小孢子培养时选取的材料正处于细胞旺盛分裂和对环境敏感阶段，其诱变率是诱变种子的数十倍；所需诱变剂浓度较低，降低了诱变剂对细胞的生理毒害；小孢子培养获得的双