重组蛋白和多肽的分离纯化.docx

重组蛋白和多肽的分离纯化1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstreamprocessing）阶段这一过程又和上游过程紧密相联系上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计并充分考虑上游因素对下游的影响如是否带有亲和标签是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类分别是大肠杆菌表达系统、表达系统和CHO细胞表达系统不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程目标蛋白表达是否形成包涵体目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外）蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤并且由于蛋白质种类少目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白可能是可溶性表达可能形成包涵体可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤而包涵体易于分离纯度较高但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难需要对聚集的蛋白进行变复性通常活性蛋白的得率比较低表1列出了不同策略对表达、纯化的影响对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化并能保护目标蛋白不被降解（96）。重组蛋白不同表达策略的优点和缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中除了目标蛋白外还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离得到一定的量达到一定的纯度同时要尽可能保留蛋白的生物活性并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度并对处方有活性和稳定性的要求对于某些酶的纯度则要求较低需要在纯度和得率之间进行一个平衡所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构对于有生物活性的蛋白质在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点采用合适的操作条件和方法保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔGf→u）来衡量ΔGf→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔGf→u在5—20kcal/mol范围之间单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化因此ΔGf→u相对比较小这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点所以必须克服蛋白质内在的不稳定性保留蛋白的活性。这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等这些因素对折叠的影响有的是可逆的有的是不可逆的而且相互之间也有影响在实际处理中应选择合适的条件尽量避免不利因素的影响（2）并利用活性跟踪的方法对处理进行评价指导分离纯化。在进行任何纯化工作时第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性如酶的活性免疫学活性物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等）生物学活性。在理想的情况下我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性以排除假阳性。快速则要求能很快的给出定性和定量结果以便更好的与分离纯化的工作相衔接。灵敏的分析方法仅需要少量的样品这就给操作带来了极大的方便。在分离纯化的每一步都需要对蛋白和活性进行定量这就要求分析方法有准确可定量的特点以对分离纯化的效果进行评价。如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质由于电泳的分辨率限制常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到