细胞凋亡的检测.pdf

细胞凋亡的检测生64范泓洋2006030003细胞凋亡的检测实验人：生64范泓洋2006030003同组实验：刘婧娟实验日期：2008年5月8日1.实验目的1.1了解细胞凋亡的基本概念及其意义1.2了解细胞凋亡的诱导及检测方法，学会区分凋亡不同阶段的细胞1.3学习Hoechst33258染色方法2.实验原理细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。细胞凋亡有确保正常生长、发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能的作用。凋亡过程中的细胞在形态学和很多生化指标上与正常细胞和坏死的细胞都有明显区别。区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小破损体染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬噬基因组有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状DNA蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物。Hoechst33258为特异性DNA染料，与A-T键结合，但在pH2.0环境下则优先与RNA结合，染色DNA时应调整染液的pH至7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存。1细胞凋亡的检测生64范泓洋20060300033.实验材料、试剂及器械3.1材料：Hela细胞3.2试剂：H2O2溶液，DMEM培养基，PBS溶液，胰酶-EDTA溶液，Hoechst33258染料，甲醇3.3器械：离心机，EP管，pippet，正置荧光显微镜，盖玻片，载玻片，镊子4.实验步骤4.1向传代24小时后的Hela细胞系（DMEM培养液1ml，贴壁50%）中加入100μlH2O2溶液，继续培养24小时4.2收集细胞(200uL胰酶37℃消化2min后，再加入1mL培养基)至1.5mLEP管，1000g离心5min4.3吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇，室温固定10min4.41000g离心5min4.5弃上清，加100uLPBS洗涤沉淀细胞4.61000g离心5min，4.7弃上清，加40uLPBS和10uLHochest33258染液，于37℃染色10min4.81000g，离心5min4.9弃上清，加100uLPBS洗涤；4.101000g，离心5min4.11弃上清，加15uLPBS重悬细胞4.12取15uL悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察并选取典型凋亡阶段的细胞拍照5.实验结果由于Hoechst33258染色法只能将细胞核染色，所以只能由核质的形态变化来推测正在凋亡的细胞处于哪一个凋亡阶段。如图1所示，细胞核质明显分散，细胞开始边集化。图1.凋亡过程中的Hela细胞。在10*40倍镜下观察，明显可见被Hoechse33258染色的细胞核成颗粒状分散在细胞内，形成一簇亮点。2细胞凋亡的检测生64范泓洋2006030003正在凋亡的Hela细胞图2.凋亡过程中的Hela细胞。在10*40倍镜下观察，细胞核固缩成普通细胞细胞核的1/3，其亮度有明显增加。图3.凋亡过程中的Hela细胞。在10*40倍镜下观察，细胞和已经分散成几部分，有部分区域染色明显加深，为核质固缩区域，其余部分染色较暗且模糊，调整焦平面可获得更好的观察效果，可见细胞的立体性。6.思考与讨论6.1影响凋亡诱导的因素：细胞生长状况：诱导前应观察细胞生长状况，如果细胞活力较旺盛则可以选择进行凋亡诱导，但如果细胞生长状态较差则应该选择换培养基继续培养，因为诱导剂对细胞有很大的伤害，生存状态本来就不好的细胞很可能由于诱导剂的引入而直接坏死而不进入程序性死亡的过程。诱导剂：本实验用的是H2O2进行凋亡诱导，对人体伤害不大，不是特异性诱导凋亡的试剂。如果加如诱导剂不均匀则会发生浓度高的地方细胞大部分死亡而浓度低的地方细胞基本没有诱导成功的现象。不同细胞和不同的诱导剂对凋亡诱导效果有影响。6.2为什么很难见到凋亡小体？我认为凋亡小体因为质量较小，在离心过程中可能悬浮在上清液中被吸弃了，或者因为附着力不够，在第一步PBS清洗的过程中就被洗掉了。通过查资料得知凋亡小体有双层核膜及内质网和线粒体与深染的染色质，是可以被染色的，不会因为染色的原因而不被观察到。可以考虑直接在培养皿上进行染色，或者