细菌内毒素检查法介绍.pdf

细菌内毒素检查法中国食品药品检定研究院化药所药理室蔡彤中国食品药品检定研究院NationalInstitutesforFoodandDrugControl中国食品药品检定研究院简介凝胶法光度测定法实验涉及内容及相关要求NationalInstitutesforFoodandDrugControl简介•细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一：LPS•在细菌死亡后释放NationalInstitutesforFoodandDrugControl简介•细菌内毒素具有：耐热性不易灭活（180℃、2小时；250℃、30分钟）分子极性易聚集、吸附，需充分混合高致热性作用于人体，会引起发热、寒战、休克、甚至死亡NationalInstitutesforFoodandDrugControl简介•细菌内毒素检查法检验•注射用药品（内毒素）防止发生•临床热原反应安全性试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素检查方法的分类•细菌内毒素检查方法包括：浊度法动态浊度法限度实验光度测定法终点浊度法凝胶法半定量实验（定量实验)显色基质法动态显色法终点显色法•可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素检查凝胶法NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法凝胶法系利用细菌内毒素与鲎试剂反应可形成凝胶的原理，来测定供试品中的内毒素含量是否符合规定。NationalInstitutesforFoodandDrugControl反应原理内毒素（旁路反应）二价离子pH6.0~8.0β-葡聚糖C因子活化的C因子活化的G因子G因子B因子活化的B因子凝固酶原凝固酶鲎试剂凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•主要操作：将供试品溶液0.1ml+鲎试剂0.1ml在管中混匀，37℃+1℃下反应60+2min。•如果供试品溶液中所含的内毒素≥鲎试剂的灵敏度就会形成坚实凝胶。•灵敏度：所用鲎试剂能够检测的最低内毒素浓度。NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者•坚实凝胶•阳性“+”NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•未形成凝胶•凝胶不坚实、变形、从管壁滑脱者•阴性“—”NationalInstitutesforFoodandDrugControl假阴性、假阳性供试品溶液假阴性（抑制干扰）鲎干扰作用试毒内剂素假阳性（增强干扰）干扰因素NationalInstitutesforFoodandDrugControl干扰作用•大部分的干扰作用都可以通过使用细菌内毒素检查用水稀释供试品的方法排除。•当有些干扰作用仅使用稀释法不能排除时，可采用其他方法消除干扰因素，然后再进行试验。NationalInstitutesforFoodandDrugControl干扰作用常见干扰因素及排除方法干扰因素干扰作用类型排除方法供试品溶液本身为强酸、强抑制将供试品的pH值调节碱，或本身具有偏酸偏碱的至6.0~8.0缓冲作用含有螯合剂（如EDTA）抑制添加适当Ca2+、Mg2+含有某些抗凝因子抑制将供试品适当加热，使抗凝因子失活含葡聚糖类物质增强使用抗增液或特异性鲎试剂NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法——有3个部分新鲎试剂在使用前•鲎试剂灵敏度复核要对其灵敏度进行复核•干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验•检查法：限度试验半定量试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•鲎试剂灵敏度复核•干扰实验：预实验（SOP）新品种在建立细菌内毒素检查法时需使用干扰试验进行方法正式干扰实验学研究，以验证样品是否对内•检查法：限度试验毒素与鲎试剂的反应存在干扰半定量试验作用，确定在何条件下不再存在干扰作用，可得到准确可靠的检验结果。NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•鲎试剂灵敏度复核•干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验•检查法：限度试验半定量试验日常检验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•鲎试剂灵敏度复核•干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验•检查法：限度试验半定量试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•鲎试剂灵敏