盐芥TsHKT1;3启动子的克隆与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110229824A(43)申请公布日2019.09.13(21)申请号201910389696.4(22)申请日2019.05.10(71)申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号(72)发明人左开井熊雅丽(74)专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司31236代理人庄文莉(51)Int.Cl.C12N15/29(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/20(2018.01)权利要求书1页说明书7页序列表4页附图3页(54)发明名称盐芥TsHKT1;3启动子的克隆与应用(57)摘要本发明公开了一种盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用；本发明通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体TsHKT1；3::GUS，并经农杆菌花序侵染法转化拟南芥，对转基因拟南芥进行染色观察；结果表明，TsHKT1；3在拟南芥苗期是一种根特异性启动子。此外，对盐芥各组织的相对荧光定量PCR结果也表明，TsHKT1；3在盐芥中是一种根特异性启动子，且不受盐胁迫诱导。因此，该启动子是一种较为稳定的盐芥根特异性启动子，可以在植物基因改造工程中作为功能元件驱动相关功能基因的表达，具有改善植物根部特性的潜力。CN110229824ACN110229824A权利要求书1/1页1.一种盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。2.一种盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3启动子，所述启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物GUS表达载体pCambia1305.1的酶切位点插入如权利要求2所述的TsHKT1；3启动子得到的重组质粒；在所述重组表达质粒中，TsHKT1；3启动子连接在GUS基因的上游。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述酶切位点为HindⅢ和NcoⅠ。5.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述插入使用的扩增引物为序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所述的引物对。6.一种如权利要求3所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、以TsHKT1；3启动子克隆载体为模板，采用序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所述的引物对，利用高保真酶进行PCR扩增；S2、将PCR扩增片段和载体pCambia1305.1利用HindⅢ和NcoⅠ酶切，利用T4连接酶连接；S3、连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，即得所述重组表达载体。7.如权利要求6所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述TsHKT1；3启动子克隆载体是通过包括如下步骤的方法制备而得的：A1、利用CTAB法提取盐芥整株DNA；A2、以所述DNA为模板，采用序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所述的引物对，利用高保真酶进行PCR扩增；A3、PCR扩增片段连接至pMD19-T中，转化大肠杆菌感受态DH5α，即得所述TsHKT1；3启动子克隆载体。8.一种如权利要求3所述的重组表达载体的应用，其特征在于：将所述重组表达载体转入农杆菌GV3101中，利用花序侵染法侵染拟南芥植株；所收种子经多代潮霉素筛选，最终收获纯合株系。9.一种如权利要求3所述的重组表达载体的应用，其特征在于：将所述重组表达载体转入拟南芥，盐胁迫处理观察其GUS染色结果。2CN110229824A说明书1/7页盐芥TsHKT1;3启动子的克隆与应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用。背景技术[0002]在农业生产中，盐胁迫是一种非常重要，并能直接影响农作物产量的非生物胁迫。因此，了解植物如何响应外界盐胁迫的过程是十分重要的。HKT1类型的转运蛋白在植物盐胁迫过程中发挥了重要的作用。在模式植物拟南芥中，只存在一个HKT1类型的基因，即AtHKT1。而在盐生植物，也是拟南芥的近亲物种盐芥中，却存在着三个HKT1基因，分别是TsHKT1；1，TsHKT1；2，TsHKT1；3。研究这三个基因的功能和表达谱对于解析植物响应盐胁迫的过程是十分重要的。[0003]常见的启动子可分为组成型启动子，组织特异型启动子和诱导型启动子。在一些情况下，一种类型的启动子可能兼有其他类型启动子的特性。组织特异型启动子在植物基因工程中具有重要的功能，它可使外源基因在转基因植物中定位表达，从而提高外源基因在特定部位的作用，增加转基因的效果，改善作物的农艺性状。[0004]在土壤中，