蒲公英多糖体外抑瘤和抗突变作用研究.docx

蒲公英多糖体外抑瘤和抗突变作用研究【摘要】目的观察蒲公英多糖对肝癌细胞的抑制和抗突变作用。方法采用MTT法测定蒲公英多糖对肝癌细胞的抑制作用，用微核实验检测抗突变作用。结果蒲公英多糖随浓度的增加对肝癌细胞的抑制率增加，但不明显;可以显著提高外周血细胞免疫力，拮抗由环磷酰胺诱发的微核突变(P【关键词】蒲公英多糖抑瘤微核突变蒲公英TaraxacumL.是中医临床常用的中草药,具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋、健胃消炎、保肝利胆等功效[1]。研究发现，蒲公英有抗菌[2]、抗突变[3]、抑瘤[4]、抗氧化[5]等多种药理作用，并能提高机体免疫性，对抗环磷酰胺引发的DNA损伤[6]。蒲公英根部富含多糖[7]，研究发现多糖具有广泛的药理作用，其中多糖诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖是目前研究的热点;同时外界环境诱发的突变是肿瘤细胞形成的重要因素之一。本文就蒲公英多糖对肝癌细胞的.抑制以及对环磷酰胺诱发的突变的拮抗作用进行了研究。1、材料与仪器1.1试剂PMI1640，美国GIBCO产品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品;环磷酰胺(CP)，上海华联制药公司产品;噻唑兰(MTT)，Sigma公司产品;植物血凝素(PHA)，金尔康动物药业有限公司;DMSO，北京索莱宝科技有限公司产品;Giemsa，Sigma公司产品。1.2材料东北蒲公英T.ohwianumKitag.采自黑龙江省五大连池自然风景区。蒲公英多糖的制备参照文献[8]法进行。肝癌细胞Bel-7402和正常人外周血淋巴细胞均由齐齐哈尔医学院馈赠。1.3仪器KHB全自动酶标仪(ST-360)，北京桑翌实验仪器研究所产品;细胞培养箱，河北省虹宇仪器设备有限公司产品;96孔板，Greiner公司产品;超净工作台，ESCO公司产品。2、方法2.1MTT法[9]检测蒲公英多糖对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用运用改良的MTT实验[9]计算蒲公英多糖对肿瘤的抑制作用，蒲公英多糖的终浓度为25，50，100，200，400，800，1600，3200μg/ml。阳性对照加CP，终浓度为260μg/ml;每个浓度均设6个平行孔。酶标仪的吸收波长采用570nm。抑制率(IR)=(空白对照组OD值-多糖组OD值)/空白对照组OD值。采用SPSS数据包进行方差分析。2.2微核实验检测蒲公英多糖拮抗环磷酰胺诱发的微核突变常规采人外周血与培养[10]。细胞培养24h后，将蒲公英多糖用PBS溶液配成溶液，微孔滤膜过滤(0.2μm)。将多糖溶液加到培养瓶内，使多糖浓度分别为50，200，800，3200μg/ml。继续培养24h后，向每瓶内加入25mlCP，使CP浓度达到100μg/ml。另设空白对照组和CP阳性对照组，空白对照组加PBS不加CP，CP阳性对照组加CP不加多糖。制片采用文献[10]法进行。统计：观察计数1000个可计数转化细胞的微核(MN)数，计算千分率(MN‰)。用SPSS软件包分析各组数据。抑制率(%)=(阳性组MN数-实验组MN数)×100/阳性组MN数。3、结果3.1蒲公英多糖体外抑瘤作用蒲公英多糖对肝癌细胞Bel-7402的细胞毒作用见表1。结果显示，随着蒲公英多糖浓度的增大，对肿瘤细胞的抑制作用也在增大，即蒲公英多糖对肿瘤细胞的抑制作用存在量依赖关系。但是即使在很大的浓度下(3200μg/ml)，多糖对肿瘤细胞的抑制率仅为27.94%，而此时蒲公英多糖溶液中已出现很少量的不溶解的多糖，因此，多糖的实际浓度未能达到实验设计的水平。而CP在较低浓度(260μg/ml)下对肿瘤细胞的抑制作用就已经很显著了(IR>30%)。一般认为，只有当抑制率达到30%以上才说明肿瘤细胞对药物敏感[11]，蒲公英多糖对肿瘤细胞的最大抑制率小于30%，故认为蒲公英多糖对肝癌细胞Bel-7402没有明显的抑制作用。表1蒲公英多糖对Bel-7407的抑制作用(略)3.2蒲公英多糖拮抗CP诱发的微核突变CP是一种烷化剂，是临床常用的免疫抑制剂，能够抑制细胞的增殖，常做抗癌药物;同时它对正常细胞DNA的合成及分裂具有强烈的抑制作用，从而明显诱发微核产生。由表2可知，阳性对照组(CP组)与空白对照组的微核率相差极为显著(P4、讨论本实验表明，蒲公英多糖对肿瘤细胞的抑制作用存在着剂量效应，但是抑制作用不明显。抑制作用不明显可能是由于以下几种原因：①应用体外细胞培养进行抗肿瘤药物的筛选有周期短、结果显而易见的优点，但是也存在着一定的局限性，主要表现在：假阴性结果导致有效药物的漏筛。有些药物如生物反应调节剂需要通过机体的反应才能对细胞起作用，有些药物必须经过体内酶的代谢活化才能变成活性成分，此类药物在进行体外筛选时就会产生假阴性结果，从而导致有效药物的漏选，因此，体外试验的结果必须通过体内试验进一步验证。②本实