一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111471696A(43)申请公布日2020.07.31(21)申请号202010365861.5A61P31/16(2006.01)(22)申请日2020.04.30(71)申请人山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）地址250023山东省济南市天桥区交校路1号(72)发明人于志君朱彤吴家强(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人李筝(51)Int.Cl.C12N15/44(2006.01)C12N15/85(2006.01)C12N7/01(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表2页附图2页(54)发明名称一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用(57)摘要本发明提供一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用。所述构建方法包括：将包含D型流感病毒PB2、PB1、P3、HEF、NP、M和NS基因的重组载体共同导入宿主细胞进行包装得到重组病毒。本发明为D型流感病毒跨种传播机制的研究奠定了良好基础，并提供了可行的技术平台；同时有利于制备预防/治疗D型流感病毒的相关产品；另外，本发明构建方法还具有操作简便、成本较低等优点，因此具有良好的实际应用之价值。CN111471696ACN111471696A权利要求书1/2页1.一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述方法包括将D型流感病毒的PB2、PB1、P3、HEF、NP、M和NS基因片段共同导入宿主细胞进行培养获得D型流感病毒。2.如权利要求1所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述PB2、PB1、P3、HEF、NP、M、NS基因片段来源于流感病毒M628株，其GenBank登记号为KF425652.1-KF425658.1。3.如权利要求1所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述PB2、PB1、P3、HEF、NP、M、NS基因片段通过构建重组载体的方式共同导入宿主细胞中。4.如权利要求3所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述重组载体构建方式如下：将PB2、PB1、P3、HEF、NP、M或NS基因片段入表达载体的多克隆位点中进行构建；优选的，所述表达载体为pFluDD，所述载体由pUC18载体(ThermoFisherScientific公司)改造而成，具体是将CMV启动子、鼠RNA聚合酶I终止子、人RNA聚合酶I启动子和SV40多聚腺苷酸化信号依次插入到pUC18载体上构建获得。5.如权利要求1所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、HL-8细胞中的一种或多种，优选的，所述宿主细胞为293T细胞。6.权利要求1-5任一项所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法制备得到的重组D型流感病毒。7.一组序列，其特征在于，所述序列如下：SEQIDNO:1所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATGTCA-3’SEQIDNO:2所示：5’-TTTTGGGCCGCCGGGTTATTAGCAGTAGCAAGAGGATTTT-3’SEQIDNO:3所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATTTTA-3’SEQIDNO:4所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTTAG-3’SEQIDNO:5所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGAGATTTTC-3’SEQIDNO:6所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTATT-3’SEQIDNO:7所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATATTT-3’SEQIDNO:8所示：5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGGGTGTACA-3’。8.权利要求7所述序列在构建重组D型流感病毒中的应用。9.权利要求6所述重组D型流感病毒或权利要求7所述序列在以下任意一个方面的应用：1)D型流感病毒跨种传播机制研究；2CN111471696A权利要求书2/2页2)制备预防/治疗流感病毒产品。10.如权利要求9所述重组D型流感病毒或序列在以下方面的应用，其特征在于，所述产品为药物或试剂盒。3CN111471696A说明书1/7页一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用技术领域[0001]本发明属于病毒反向遗传系统构建技术领域，具体涉及一种构建D型流感病毒反向遗传系