参与猪传染性胃肠炎病毒感染的靶点及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114107311A(43)申请公布日2022.03.01(21)申请号202111168854.7C12N15/113(2010.01)(22)申请日2021.09.30A61K31/7088(2006.01)A61K45/00(2006.01)(71)申请人华中农业大学A61P31/14(2006.01)地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山A61P31/16(2006.01)街1号A61P31/22(2006.01)(72)发明人彭贵青孙丽蒙赵书红谢胜松赵长志付亚楠付贞张金福李新云苏哲琳周媛项怡馨(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所(普通合伙)42001代理人江丽丽(51)Int.Cl.C12N15/12(2006.01)C12N15/867(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表1页附图4页(54)发明名称参与猪传染性胃肠炎病毒感染的靶点及其应用(57)摘要本发明公开了一类参与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染的靶点及其应用，利用猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库技术，高通量筛选参与TGEV感染作用的靶点。实验证明，利用CRISPR/Cas9技术敲除候选靶点，能显著抑制TGEV的复制能力，特别是构建了TMEM41B、LPP、TAX1BP1和BARHL2敲除细胞株，并通过实验证明敲除这些基因能赋予宿主细胞TGEV的抗性，还发现敲除TMEM41B能抑制猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪萨佩洛病毒（PSV）、水疱性口炎病毒(VSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒（JEV）和A型流感病毒（IAV）复制。CN114107311ACN114107311A权利要求书1/1页1.靶点在制备抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV感染药物中的应用，其特征在于，所述的靶点包括：TMEM41B、LPP、TAX1BP1和BARHL2。2.TMEM41B、LPP、TAX1BP1和BARHL2基因作为靶点在制备抗猪传染性胃肠炎病毒感染的基因编辑细胞和动物模型中的应用。3.TMEM41B基因作为靶点在制备抗猪德尔塔冠状病毒PDCoV、猪萨佩洛病毒PSV、水疱性口炎病毒VSV、伪狂犬病病毒PRV、日本乙型脑炎病毒JEV、A型流感病毒IAV感染药物和抗病分子育种中的应用。4.用于防治猪传染性胃肠炎病毒TGEV感染的药物，其特征在于，所述的药物为TMEM41B、LPP、TAX1BP1和BARHL2基因或其编码蛋白的靶向抑制剂。5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，包括Cas蛋白和靶向TMEM41B、LPP、TAX1BP1和BARHL2基因的sgRNA。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，靶向TMEM41B、LPP、TAX1BP1和BARHL2基因的sgRNA的序列分别如SEQIDNO.1‑4所示。2CN114107311A说明书1/8页参与猪传染性胃肠炎病毒感染的靶点及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及利用猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库技术，高通量筛选并鉴定到一类参与猪传染性胃肠炎病毒感染的靶点及其应用。背景技术[0002]动物疾病不仅危害畜牧产业，同样危害着人类健康。如SARS、禽流感和乙型脑炎等人畜共患病，对动物和人类都是一种极大的威胁。如何控制病原微生物感染与传播是近年来一直被关注的热点问题。[0003]对于已经有预防性疫苗的传染病，给易感猪群接种疫苗是最为保险的方法。但有些病毒变异快，疫苗防控困难。从遗传上提高畜禽本身的抗病能力从而改善畜禽的健康和畜产品的安全，是当前亟须解决的重大问题，也是国家重视的畜禽种业技术难题。[0004]目前利用基因编辑抗病育种手段改造宿主基因，从而提高宿主的抗病能力，实现阻止病毒感染已有成功的案例报道。如基因编辑抗蓝耳病猪和抗结核病转基因牛。但这种方法的关键之处在于发现病原微生物感染必需的关键宿主基因。因此，如何在动物细胞中实现高通量筛选与病原微生物互作的宿主关键基因是亟需解决的核心技术问题。[0005]猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种：猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。其中，猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性猪传染病。不同日龄的猪均可感染，新牛仔猪死亡率较高(通常100％)。目前该种疾病还没有特效治疗药物，发病后要及时采取措施，需将患病猪扑杀进行无害化处理。[0006]尽管TGEV疫苗是预防流行性猪传染性胃肠炎的有效措施，但由于TGEV感染机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗药物，尤其