一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114539348A(43)申请公布日2022.05.27(21)申请号202210087732.3(22)申请日2022.01.25(71)申请人四川省农业科学院水稻高粱研究所地址618000四川省德阳市旌阳区玉泉路508号(72)发明人刘茂柯刘成元田新惠唐玉明冯军张涛王思思倪先林郭小蛟(74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所(普通合伙)11491专利代理师王峰刚(51)Int.Cl.C07K1/14(2006.01)C07K1/30(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图2页(54)发明名称一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法(57)摘要本发明属于白酒酒醅技术领域，公开了一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，称取酒醅样品，并加入酚抽提取液和蛋白酶抑制剂；冰上超声破碎；用玻棒去除谷壳；对溶液进行离心，用移液器吸取中层溶液，转移至新的离心管中；在两次转移得到的溶液混合中加入等体积的酚‑Tris‑HCl饱和溶液进行离心，收集酚上层；加入预冷0.1M醋酸铵‑甲醇溶液，沉淀离心；加入预冷甲醇清洗，并离心，收集沉淀；以丙酮代替甲醇去除甲醇，收集沉淀；溶解于样品裂解液中，将溶液进行离心，取上清，并再次离心取上清。本发明显著提高酒醅微生物蛋白质定性鉴定结果的可靠性和鉴定物种的多样性，为深入揭示酒醅微生物的多样性及生理功能奠定基础。CN114539348ACN114539348A权利要求书1/2页1.一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，包括：步骤一，称取酒醅样品，放入灭菌离心管中；并向灭菌离心管中加入酚抽提取液和蛋白酶抑制剂，终浓度为1mM；步骤二，冰上超声破碎，超声结束后，用玻棒将上层漂浮的谷壳去除，同过程重复1次；谷壳去除完成后，对溶液进行离心；离心完成后，用移液器吸取中层溶液，转移至新的离心管中；同法重复1次，将两次转移的溶液混合；步骤三，在步骤二中两次转移得到的溶液混合中加入等体积的酚‑Tris‑HCl饱和溶液，并进行混均；对混合溶液进行离心，收集酚上层；再加入预冷0.1M醋酸铵‑甲醇溶液，过夜沉淀，离心，收集沉淀；步骤四，加入预冷甲醇进行清洗，轻微混合；并进行离心，收集沉淀，重复一次；以丙酮代替甲醇重复上述过程两遍，充分去除甲醇；去除甲醇完成后，收集沉淀；在常温下进行干燥，溶解于样品裂解液中，室温溶解一定时间；步骤五，将溶液在室温下进行离心，取上清，并再次离心取上清；上清即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于一定温度下备用。2.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤一中，称取酒醅样品质量为1g。3.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤一中，灭菌离心管中加入酚抽提取液和蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1mM，具体过程为：称取1g酒醅样品，放入灭菌离心管中；加入2mL酚抽提取液[蔗糖0.70mol/L、NaCl0.01mol/L、EDTA‑2Na0.04mol/L、二硫苏糖醇0.01mol/L、Tris‑HCl(pH6.8)0.13mol/L、Tris‑HCl(pH8.8)0.38mol/L]，加入蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟)使其终浓度为1mM。4.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤二中，冰上超声破碎过程具体为：冰上超声破碎，功率80W，超声1.0s,关闭1.0s,共3min。5.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤二中，谷壳去除完成后，对溶液进行离心具体过程为：4℃，2000rpm离心20min。6.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤三中，加入等体积的酚‑Tris‑HCl饱和溶液，并进行混均，具体过程为：加入等体积的酚‑Tris‑HCl饱和溶液(pH7.8)，4℃混合30min，期间多次摇晃混匀。7.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤三中，对混合溶液进行离，心收集酚上层，具体过程为：4℃，8000rpm离心10min，收集酚上层。8.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤三中，加入预冷0.1M醋酸铵‑甲醇溶液，过夜沉淀，离心，收集沉淀，具体过程为：加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵‑甲醇溶液，‑20℃过夜沉淀；4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀。9.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所2CN114539348A权